利用基因敲除小鼠研究mxi1抑制系膜增殖的新机制

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1、南开大学博士学位论文利用基因敲除小鼠研究Mxi1抑制系膜增殖的新机制姓名：刘晓峦申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：陈香美2012-05中文摘要背景：系膜增生性。肾小球肾炎(IgA肾病和非IgA系膜增生性肾炎)是我国最常见的慢性肾脏病，是导致终末期肾脏病的主要病因。研究系膜增殖的分子机制，探讨有效的治疗措施，具有非常重要的意义。我们的前期研究发现，影响系膜细胞增殖的因子(包括增殖促进因子和增殖抑制因子)在系膜增生性‘肾炎的发病过程中起重要作用，其中MAX作用因子1(MAXinteractor

2、1，Mxil)在抗．Thyl肾炎模型的系膜增殖期表达水平明显降低，在增殖恢复期表达水平又逐渐回升，提示该基因在系膜增生性肾炎的病理过程中发挥作用。目的：本课题以Mxil为切入点，研究Mxil基因敲除在小鼠体内对系膜细胞增殖水平及肾小球蛋白质表达谱的影响，利用Mxil基因敲除鼠建立系膜增生性肾炎模型观察其对模型病理过程的影响，并在体外实验中证实其作用，以明确Mxil是否是一种系膜增殖抑制因子及其是通过何种机制发挥系膜增殖抑制作用的。方法：取12周龄雄性Mxil州+、Mxil¨、Mxil小小鼠各6只

3、，PAS染色观察肾组织病理变化并计数肾小球内有核细胞数，PCNA免疫组化及Westernblot观察细胞增殖情况，Westernblot检测desmin的表达：利用2D．LC／MS分析Mxil+／+与Mxil以小鼠肾小球蛋白质表达谱的差异，并对部分增殖相关蛋白质的表达进行验证；利用Mxil卅与Mxil士小鼠，以尾静脉注射竹叶青蛇毒素(3．5mg／kg)建立系膜增生性肾炎模型，PAS染色观察肾组织病理变化并进行病理评分，PCNA免疫组化观察细胞增殖情况，Westernblot检测肾小球p-ERKl

4、／2、ERKI／2(2D．LC／MS检出的差异表达蛋白质)的表达；利用质粒和siRNA转染的方法调控体外培养的系膜细胞Mxil的表达水平，CCK．8法检测细胞增殖水平，流式细胞技术检测细胞周期进程，Westernblot检测ERKl／2通路分子的表达，并观察ERKl／2通路特异性抑制剂U0126对Mxil调控系膜细胞增殖作用的影响。结果：(1)Mxil+／+d、鼠肾组织未见明显病理改变，Mxil。小鼠部分肾小球出现轻．中度系膜细胞增殖。与Mxil刊+小鼠相比，Mxil以小鼠肾小球内有核细胞数略中

5、文摘要有增多，肾小球PCNA表达水平明显升高，且desmin表达水平升高。(2)通过2D．LC／MS检测共得到差异表达蛋白质129个，其中在Mxil乒小鼠。肾小球中表达上调的蛋白质65个，下调的蛋白质64个。对差异表达蛋白质中可能与细胞增殖有关的MAPKl(即ERK2)、MAPK3(即ERKl)、Pycard、histoneH2B、catalase、Slc5a8、Skpl的表达进行Westernblot验证，变化趋势与2D．LC／MS结果基本一致。其中在Mxil-／-小鼠肾小球中，ERKl／2蛋

6、白质表达水平升高。(3)造模后Mxil斗小鼠的存活率低于Mxil+／+d、鼠。肾脏病理显示在造模后第l、3天，小鼠出现肾小球系膜溶解病变，造模后第-7天，Mxil叫+小鼠除系膜细胞增殖及系膜基质增多外，其他病变基本消失，Mxil士小鼠系膜区呈弥漫显著增殖，并有部分肾小球出现节段硬化、球囊粘连等病变，病理评分明显加重。各时间点模型小鼠PCNA的表达均明显高于对照组，在注射HSV后第1、3天，Mxil4小鼠PCNA的表达高于Mxil卅小鼠。与对照组相比，模型小鼠肾小球P．ERKl／2与ERKl／2的

7、表达明显升高，且各时间点Mxil士小鼠P．ERKl／2的表达均高于Mxil州+小鼠。(4)与对照转染组相比，Mxil质粒转染可明显降低体外培养的系膜细胞的增殖能力，使处于S期的细胞明显减少，并显著抑制ERKl／2通路分子P．ERKl／2、ERKl／2、P．MEK、MEK、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK6的表达；而siMxil转染可引起相反的结果。U0126可抑制siMxil转染引起的系膜细胞增殖水平升高，siMxil+U0126组细胞增殖水平明显低于siMxil组，且高于U0

8、126组。结论：本研究发现：(1)Mxil基因敲除小鼠系膜细胞增殖水平升高；(2)Mxil基因敲除可使肾小球蛋白质表达谱发生明显变化，使ERKl／2蛋白质表达水平升高；(3)与野生型小鼠相比，利用Mxil基因敲除鼠建立系膜增生性肾炎模型后，小鼠系膜细胞增殖程度更高，病理损伤加重；(4)在体外培养的系膜细胞中过表达Mxil可抑制细胞增殖，同时抑制ERKl／2通路分子的表达，低表达Mxil可引起相反的结果，而ERKl／2通路抑制剂则可拮抗Mxil低表达引起的系膜细胞增殖水平升高。综上所述，本课题通过