雌激素受体-α36过表达对人乳腺癌细胞mcf-7生物学行为的影响

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1、郑州大学博士学位论文雌激素受体--α36过表达对人乳腺癌细胞MCF--7生物学行为的影响姓名：刘旺根申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：张钦宪；王云龙201204摘要雌激素受体．Q36过表达对人乳腺癌细胞MCF．7生物学行为的影响博士研究生：刘旺根导师：张钦宪教授王云龙教授郑州大学基础医学院河南省郑州市450001摘要乳腺癌是全球妇女中最常见、发病率上升最快、X线检查最多、活检量最多、社会支出最大的恶性肿瘤。据2011年2月4日美国痛症协会(AmericanCancerSociety,ACS)对全球痛症统计学数据报告显示，乳腺痛是女性最常见的痛症(2

2、3％)，乳腺癌相关死亡率也居女性癌症死亡率之首(14％)。近10年来，我国乳腺癌发病率以每年3％的速度递增，总体发病率较10年前增长了37％，死亡率增长了38．9％，发病年龄也比发达国家的发病年龄提前了15-20岁，是严重威胁我国女性健康的恶性肿瘤之一。雌激素是一种重要的类固醇激素，通过雌激素受体(estrogenreceptor，ER)的介导，参与调节作用于生殖系统和非生殖系统的多种生理功能，并与多种临床疾病相关，其中乳腺癌最受关注。生理状态的雌激素信号参与乳腺上皮细胞的增殖和分化，不规则的雌激素信号可刺激细胞增殖，因而增大乳腺癌风险。传统的雌激素受体．a(estr

3、ogenreceptor-or，ER．∞蛋白由595个氨基酸组成，分子质量为66kDa，现称之为ER—a66。2005年，一种分子量为36kDa的ER．a新亚型被鉴定、克隆，因其分子质量为35．7kDa，而命名为ER．a36。与ER．a66不同，ER．a36缺少ER．ct66的两个转录活性域AF—l和舡一2，但保留了的DNA结合域和部分二聚化区域以及部分配体结合域，其配体结合域的C末端以独特的27个氨基酸残基序列取代ER．a66的最后138个氨基酸，介导着与ER-a66完全不同的雌激素信号通路，可对乳腺癌细胞产生更强的生长刺激作用。目前，ER．a36的作用摘要机制已被

4、鉴定为膜启动的类固醇信号传递(membrane．initiatedsteroidsignaling，MISS)，即非基因组作用模式。在这一作用模式下，ER．a36可以通过配体依赖或非配体依赖方式激活MAPK／ERK和P13K／Akt通路。研究表明，ER．a36的表达水平与乳腺癌的进展、预后及TAM先天耐药性的产生有着密切联系。体外试验显示，在ER—a36高表达的MCF．7细胞中，TAM不但不能抑制细胞生长，反而可以刺激细胞的增殖。ER．a36和HER．2之间通过正反馈串话机制介导非基因组效应，促进乳腺癌细胞的生存，并导致对三苯氧胺(他莫昔芬，tamoxifen，TAM

5、)的原发性耐药和获得性耐药，同时，该变异体的高表达还参与介导了TAM副作用所致的子宫内膜癌。由于ER．a36不但在乳腺癌、子宫内膜癌中可以表达，也常表达于胃癌、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的组织细胞中，伴随着对ER．a36在疾病发生中的作用及机制的认识不断深入，已受到越来越多的研究机构(院所)和医疗机构的关注。特别是在对乳腺癌选择内分泌治疗方案时，有必要将ER．a36与ER．a66联合检测，以判断患者是否能从TAM治疗获益。通过ER．0．36的表达水平，可为乳腺癌类型进一步分类，有助于对内分泌治疗的预后判断，也可进一步推广运用于雌激素相关疾病的预警、发生发展情况的监测和

6、临床评价。但目前尚无商业化的ER—a36抗体，国内近几年围绕ER-a36蛋白所做的一些研究工作所用的ER—a36多抗，大多是国外的研究机构惠赠或是通过诱导表达ER．a36与标签蛋白的融合蛋白进行间接观察，国际、国内更是尚无针对ER．a36的检测试剂获得批准上市。这给鉴定ER—a36在细胞内的定位、表达及其在疾病诊断和选择治疗方案中的研究带来了很大的困难。同时，也需要一种便捷、快速、高效的ER．a36与ER-a66联合检测方法，而且，ER．a36对乳腺癌生物学特性的影响及作用机制也尚未得到较为全面的阐述。鉴于此，本研究旨在制备出纯度和活性较高、特异性较强的羊抗入ER-a

7、36多克隆抗体，摸索出其在ER．a36的免疫组织(细胞)化学和蛋白印迹检测中的应用体系，为后续研究提供材料和免疫学检测方法，同时构建真核表达载体，将之转染入雌激素受体阳性的MCF．7细胞，使之获得稳定表达，以转染后的细胞为对象，探索从基因水平建立一种高效的ER-a36与ER．a66联合PCR检测方法，较为全面的探讨ER．a36对雌激素受体阳性人乳腺癌MCF．7细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制，以及睾酮对ER．a36高表达ER-a66阳性乳腺癌细胞的作用。摘要实验一抗ER-a36多克隆抗体的制备及其初步应用目的制备高纯度高效价的抗ER．a36多克隆