副猪嗜血杆菌安徽分离株的耐药性与转铁结合蛋白a免疫原性研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文副猪嗜血杆菌安徽分离株的耐药性与转铁结合蛋白A免疫原性研究姓名：黄晓慧申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：魏建忠；李郁201206摘要副猪嗜血杆菌(胁P肌叩办玎淞p口r伽”括，HPS)是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定条件下可侵入机体而引起严重的以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、肺炎、高热及高死亡率为主要特征的全身性疾病，被称为副猪嗜血杆菌病或革拉斯氏病(Glasser·sdisease)。该病已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一，给养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌目前已知的血清型有15种，且有大量无法定型的菌株，各型菌株

2、间的毒力差异及致病性差异都很大，且各血清型之间缺乏有效的交叉保护力。此外，HPS的毒力因子尚未完全被定义，这些都为Glasser’sdisease的防控及其疫苗的研制带来了很大困难。因此，开展HPS的相关研究对Glasser．sdisease的防控就具有重要的现实意义。本研究的主要内容是：①探讨安徽地区HPS分离株的耐药性及其与细菌毒力和血清型、基因型之间存在的关系，为Glasser’sdisease的治疗和防控提供科学依据；②探讨TbpA蛋白的免疫保护作用，为HPS新型亚单位疫苗的研制奠定理论基础。本研究内容包括以下部分：1．安徽地区副猪嗜血杆菌的血清型及基因型多态

3、性2008．2011年，自安徽省14个地区(猪场)的病猪病料中分离鉴定了24株副猪嗜血杆菌，采用KRG、EⅪC．RCR、PCR．I强LP对分离株的血清型和基因型进行分析。结果显示，24株HPS中以血清学4型最为流行，占29．17％(7／24)，其次为14型和13型分别占12．5％(3／24)和8．33％(2／24)，此外还有50％(12／24)的菌株不能进行定型。EⅪC．PCR将24株肿S分为11个基因型，其中Ⅳ为优势血清型，占20．83％(5／24)，其次为基因型I和基因型II，分别占16．67％(4／24)和12．5％(3／24)；RFLP．PCR将24株HPS分

4、为6个基因型，其中优势血清型为DBP和BBB，分别占37．5％(9／24)和20．83％(5／24)；不能进行血清学分型的菌株均能够得到有效地基因分型。2．副猪嗜血杆菌耐药性研究采用标准Kirby．Bauer纸片法检测了本研究室的24株HPS临床分离株对24种药物的敏感性，同时运用PCR技术检测了分离株中28种耐药基因的分布情况。结果显示，所有菌株对左氟沙星、头孢氨苄、头孢唑林钠、头孢氨噻肟、头孢曲松钠、红霉素、阿奇霉素、庆大霉素、壮观霉素、氟苯尼考、均loo％敏感；敏感率较高的有氨苄青霉素(95．8％)、羟氨苄青霉素(95．8％)、氯霉素(95．8％)、青霉素(91

5、．7％)；氧氟沙星、恩诺沙星、头孢拉定、丁胺卡那的敏感率均为(83．3％)；甲氧苄啶和强力霉素的敏感率均为75％；复方新诺明和链霉素的耐药率分别高达58．3％和54．2％；其次耐药率较高的为环丙沙星(41．7％)和四环素(37．5％)。24株HPS临床分离株表现有21种抗菌谱，仅有3株(12．5％)分离株对本试验的所有药物敏感，20．8％的菌株能耐受1．2种药物，66．7％的菌株至少对3种或3种以上的药物不敏感，20．8％的菌株至少对5种药物不敏感，有l株(4．2％)可以耐受7种药物。运用PCR技术检测了副猪嗜血杆菌分离株的28种耐药基因。24株副株嗜血杆菌中有23株

6、检测出耐药基因，检出率为95．8％(23／24)。对基因组和质粒DNA进行28种耐药基因检测，均共检测出13种耐药基因。耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致。24株肿S中以血清学4型最为流行，其次为14型和13型，其耐药率分别是14．3％、9．7％、O％。虽然不同血清型间的耐药率相差较大，但由于受检菌株数量的有限，以及大量未定型菌株的存在，使得无法探究肿S的耐药性与其血清型之间的相关性。RFLP分型中的优势血清型为DBP(37．5％)和BBB(20．83％)，其耐药率分别为19．9％和10％。结果表明，优势血清型的菌株耐药性相对较强。比较不同时期的临床分离株对药

7、物耐药性的变化趋势，可见HPS的耐药谱正逐渐拓宽，多重耐药现象也日益严重。3．HPS转铁结合蛋白A基因的克隆、表达及其对豚鼠的免疫保护效力研究参照GenBank登陆的副猪嗜血杆菌SH0165株tbpA基因序列，设计一对特异性引物，采用PCR扩增13型HPS(LJ3株)tbpA全基因，克隆到pET-SUM0原核表达载体，构建重组表达质粒pET-SUMo．tbpA，并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达，经SDS—PAGE电泳可见大小约为110kD的目的蛋白。免疫印迹试验显示重组TbpA蛋白与兔抗HPS(LJ3株)高免血清能够发生特异性反应，