用腺病毒载体介导基因转移的研究论文hbv%2fc区热点变异对小鼠免疫应答影响

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1、用腺病毒载体介导的基囤楚整研究HBV／C区热点变异对小鼠免疫应答的影响摘要国内外的研究发现HBV／C区变异与病变重度相关，但两者之间的因果关系尚未确定。本研究以重组腺病毒为载体．将含有变异位点的HBV基因组转入HepG2细胞和BALB／C小鼠，从体内和体外研究变异位点的生物学意义，旨在阐明C区变异对宿主细胞免疫和体液免疫的影响。I．重组腺病毒的构建。／用定点诱变技术，以含有1．2拷贝HBV基因组的p3．8II质粒为模板，构建含L60V和197L的突变株。采用AdEasy系统构建重组腺病毒，以分子克隆手段将HBV基因组克隆入腺病

2、毒穿梭质粒pAdTrack上，重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化大肠杆菌BJ5183细胞，通过同源重组获得重组腺病毒质粒，用PacI线性化后，转染293包装细胞，获得含野生型和变异型HBV基因的3种重组腺病毒。工，’2．重组腺病毒生物学特征的鉴定。(电镜下观察到了重组腺病毒具有典型的腺病毒形态，直径约70nm。用PCR和Southernblot证实HBVDNA已整合入腺病毒基因组，有遗传稳定性：用RT-PCR检出HBV特异的mRNA，用ELISA在感染了重组腺病毒的293细胞的培养上清中检出了HBeAg。上／‘一3．HBV基因

3、在HepG2细胞中的表达。，／用重组腺病毒感染HepG2细胞，分别用ELISA法和Westernblot从细胞上清和细胞裂解物中检出HBsAg、HBeAg和HBcAg的表达。以不同传染剂量的重组腺病毒传染HepG2细胞，结果表明，传染剂量越大，分泌性抗原的表达越强，此外，还比较了相同传染剂量的各种重组腺病毒感染HepG2细胞后其抗原表达的动态变化，发现AdHBV-WT的HBeAg表达量始终高于2个变异株；AdHBV-WT和AdHBV-L60V的HBsAg的表达量接近，而AdHBV-197L的HBsAg表达极弱。l／“，’’4．

4、重组腺病毒诱导BALB／C小鼠的免疫应答o／用AdHBV-WT、AdHBV-L60V和AdHBV-197L以滴鼻途径传染BALB／C小鼠，以接种野生5型腺病毒和生理盐水的小鼠为对照，观察HBV基因在小鼠体内诱发j的体液免疫和细胞免疫应答。重组腺病毒感染的3组小鼠均能有效地产生抗-HBc抗体，抗体水平无明显差别，所有小鼠血清中抗．HBs均阴性，仅有部分小鼠产生了较弱的摅HBe抗体。检测小鼠血清中抗．HBcIgG抗体的亚类，结果表明3个实验组小鼠血清中IgGl和IgG2a两种亚类抗体均为阳性，以lgG2a占优势，说明腺病毒诱导的对

5、HBcAg的应答以Thl类免疫为主。比较3组实验小鼠IgG2a／IgGl的比值，未发现有显著性差异，表明L60V和197L变异可能不影响Thl／Th2的分化方向。分离小鼠脾淋巴细胞，体外用重组HBcAg刺激，以3H．TdR摄入法检测小鼠T淋巴细胞的增殖反应，发现AdHBV-WT感染组小鼠强于另2组小鼠，说明AdHBV-WT诱导小鼠产生HBcAg特异性T细胞反应的能力比AdHBV-L60V和AdHBV-197L的强。人，卢7～结论：C区的2个热点变异L60V和197L与野生型相比，诱发小鼠特异性T细胞应答的能力较弱，变异位点可能

6、通过改变免疫细胞识别表位而引起T细胞应答降低，从而逃避宿主的免疫反应。因此，我们推测L60V和197L可能是免疫逃避株。／、．，——√关键词：HBV；f变异玉重组腺病毒；免疫应答、Studyontheimpactofhot-spotmutationsinHBV／CgeneontheimmuneresponseofmicebygenetransfermediatedbyrecombinantadenovirusAbstractAlthoughtherelationshipbetweenmutationsinHBV／Cregion

7、anddiseaseseverityhasbeendemonstratedinmanyepidemiologicalstudies，thecausalitybetweenthemremainsuncleaLInthisstudy,theadenoviruswasemployedasvectortotransfer1．2copiesofHBVgenomecontainingL60Vand197LmutmionsintoHepG2cellsandBALB／Cmice，toinvestigatethebiologicalimplic

8、ationsofthetwomutationsinvitroandinvivo．WeintendedtodeterminewhetherthetwomutationscouldchangetheimmunogenityofHBcAgandhadinfluenceonthehu