tlr4在小鼠脑出血炎症损伤中的作用及机制初步研究

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1、第三军医大学硕士学位论文TLR4在小鼠脑出血炎症损伤中的作用及机制初步研究姓名：钟琪申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：杨清武201205第三军医大学硕士学位论文TLR4在小鼠脑出血炎症损伤中的作用及机制初步研究2摘要脑出血(Imracerebralhemorrhage，ICH)为常见的急性脑血管病，约占脑血管疾病的10．30％，其发病率、病死率和致残率高，是人类疾病主要死亡原因之一，约70％-80％的存活者遗留明显残疾，给社会和家庭带来沉重的负担。虽历经多年研究，但至今发病机制不甚清楚、治疗手段有限。因此，深入研究其发病机制及防治措施，具有重要的临床意义。越来越多的研究表明，

2、ICH发病最初并不是病情最严重的时期，在出血后几天(一般2．3天)往往出现继发性神经损伤，引起脑损伤和神经功能缺损加剧。因此，近年来有关脑出血继发性损伤发病机制和防治研究成为热点。目前认为，红细胞裂解产物诱发的炎症反应、血肿周围代谢异常、血肿周围局部脑血流量变化是导致神经损伤加重的主要原因。特别是炎症反应具有重要作用而备受关注。已有研究证实，ICH后血肿周围组织诸如小胶质细胞等炎性细胞激活，释放诸如TNF．Q、IL．1等致炎因子，细胞间粘附分子表达增加，加之血脑屏障破坏，外周中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎症细胞向出血周边区聚集，由此诱发炎症级联反应，加重脑水肿及神经元死亡，最终导致脑损

3、伤和神经功能缺损加剧。但至今仍不清楚脑出血导致炎症反应的上游关键启动环节，即是红细胞溶解产生的什么成分?作用于小胶质细胞的什么受体?又是通过何种信号途径产生的大量炎症因子，诱发炎症级联反应?TLRs(Toll．1ikereceptors)是一类介导天然免疫的古老受体，目前发现人有11种，分别命名为TLRl．11，为IL．1受体超家族成员，是历经数亿年进化而保存的宿主天然防御机制之一。TLR4作为内毒素的跨膜受体在革兰阴性菌感染、败血症休克中的重要作用已得到公认。随后新的证据表明，TLR4在脑缺血、老年性痴呆等中枢神经系统的炎性损伤中具有重要作用。新近研究发现红细胞溶解产物血红素(He

4、me)通过作用于巨噬细胞上的TLR4产生大量炎症细胞因子，引起炎症损伤，可能是出血性疾病引起组织损伤的重要机制。本研究应用白体脑出血模型和体外小胶质细胞成分刺激模型，定性定量研究TLR4的表达变化，TLR4敲除和被抑制后的炎症变化以及血肿主要成分对小胶质细胞的炎症反应影响。本课题探讨TLR4在脑出血炎症反应中的作用及可能机制，试图明确Heme／TLR4途径是否是脑出血炎症损伤的上游启动环节之一。2国家自然科学基金资助(81070932)第三军医大学硕士学位论文主要结果：1、小鼠脑出血模型成功率87％。造模后发现小鼠对侧肢体瘫痪，运动不协调，行动迟缓，自发左转活动。行为学评分显示脑出血

5、对小鼠肢体运动有较大的影响，提示ICH造模成功。2、脑出血后研究发现TLR4mRNA在造模后第1天增加，在第3天达到高峰，在第5天下降，与小鼠神经功能缺损程度呈正相关。3、应用免疫荧光检测发现，脑未出血情况下血肿周围组织中神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞极低表达TLR4，而脑出血造模成功情况下，神经元和星形胶质细胞表达TLR4升高，但小胶质细胞表达的TLR4显著增加，变化最为显著。4、敲除TLR4后，ICH3天时小鼠脑水肿显著降低，血肿周围的外周浸润细胞减少，行为学评分显著低于WT脑出血组，血肿周围组织炎症因子TNF．0【、IL．1p和IL．6含量也显著减少。5、应用血肿主要成分Fe

6、2+，Heme，胆红素等刺激小胶质细胞，经Westernblot检测发现仅Heme可显著上调TLR4表达，小胶质细胞活化且释放的TNF一旺、IL一1D和IL．6等炎症因子显著增高，将Heme溶液注入小鼠纹状体模拟脑出血模型发现，Heme可使小鼠肢体运动受损，脑水肿升高，炎症因子TNF．0【、IL．113和IL．6释放增多。而TLR4敲除后和TLR4特异性抗体能够显著抑制Heme的炎症损伤效应。主要结论：1、小鼠自体血注入纹状体引发脑出血后，血肿边缘小胶质细胞TLR4显著上调，与神经功能缺损呈正相关。2、敲除TLR4后，脑出血炎症减弱，浸润细胞显著减少，小鼠神经功能缺损显著降低，说明T

7、LR4介导小鼠脑出血炎症损伤。3、血肿主要成分Heme可引发离体小胶质细胞TLR4激活，介导炎症因子释放，造成炎症损伤，表明Heme／TLR4是引起脑出血炎症损伤的上游关键环节之一。抑制这一环节会减轻脑出血后炎症损伤及神经功能缺损，TLR4可望成为脑出血治疗的新靶点。本研究初步阐明脑出血炎症反应造成肢体损伤的机制，揭示heme通过激活小胶质细胞TLR4介导炎症反应，造成肢体损伤，进一步明确了脑出血炎症损伤的上游关键环节，并应用拮抗抗体抑制heme引发的炎症