pi3k介导ephrinbsephbs信号相关的脊髓伤害性信息的调制

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1、浙江大学博士学位论文PI3K介导ephrinBs/EphBs信号相关的脊髓伤害性信息的调制姓名：郁丽娜申请学位级别：博士专业：疼痛机制指导教师：严敏20120517浙江大学博士学位论文中文摘要P13K介导ephrinBs／EphBs信号相关的脊髓伤害性信息的调制浙江大学医学部博士研究生导师麻醉学郁丽娜严敏中文摘要目的：EpllBs受体及印Mr毋s配体存在于成年的大脑及组织中，在各种病理过程、生理功能中具有重要作用。最近的研究发现，印蛐s作为致敏物质，通过激活中枢ep蛐s／Ep姐s信号系统引起中枢敏感化和痛觉过敏，但是机制尚未明了。P13K涉及众多生理功能和病理过程的调节。研究证明P13

2、嫦号通路参与伤害性信息调制，介导伤害刺激引起的中枢敏感化，如介导NGF／T姒和GDNF瓜默信号激活引起的中枢敏感化和痛觉过敏等。其他研究领域已有实验证实EphBs受体参与调节P13K的激活。本研究目的是证明P13K是否参与介导中枢脊髓epb—nBs／EpllBs信号激活引起的痛行为。方法：①为观察鞘内注射印MnBl．Fc是否引起时间和剂量依赖性的痛觉过敏，鞘内注射不同剂量的印11riIml-Fc(0．02，O．1，0．5昭，溶于lO山生理盐水中)，注射后30n曲，l，2，4，8，24，48h检测热缩足反射潜伏期及机械缩足反射阈值；为观察鞘内注射epllrillBl．Fc是否引起剂量依赖

3、性的脊髓背角神经元Fos蛋白表达，鞘内注射不同剂量的印啪l-Fc(0．02，O．1，0．5pg)，注射后2h，采用免疫组织化学方法检测脊髓背角神经元Fos蛋白表达。②为观察鞘内注射eph血lBl．Fc是否时间依赖性激活脊髓P13K及其下游信号蛋白IT塑坚查堂竖主堂垡堡壅!茎塑薹磷酸化AKT，鞘内注射印蛐1．FcO．5蚓10山后分别于lOIIlin、30min、lh、4h及8h时间点取注射部位脊髓，用蛋白电泳检测鞘内注射epnIlBl．Fc引起相应注射部位脊髓P13K-p110丫及p．AKT表达变化的时间相；为观察鞘内注射ep啪1．Fc是否剂量依赖性激活脊髓P13K及其下游信号蛋白磷酸化

4、Al汀，鞘内注射epl岫1-FcO．02嵋、O．1嵋、0．5p∥lO山，30min后，用蛋白电泳检测鞘内注射ephriI毋1-Fc引起相应注射部位脊髓P13K．p110丫及p一—啦汀表达变化；为观察鞘内注射epllrillBl．Fc引起AKT的激活是否通过P13K介导，鞘内注射P13K抑制剂wor缸Ila加【iIlO．4“∥10pl或LY2940025¨∥10山预处理，30min后同一部位鞘内注射印hrillBl．FcO．5叫10“l，再30min后用蛋白电泳检测相应注射部位脊髓p．AKT表达变化。③为观察P13K抑制剂对eph血圆1．Fc引起的痛行为的影响。鞘内注射印llril忸1．

5、Fc0．5“∥10“1，前30miIl(预处理)或后30miIl(后处理)鞘内注射P13K抑制剂womnall血0．016、0．08、0．4¨∥10山和LY294002O．2、1、5腭／10m，检测预处理组最后一次注射后0．5h、1h、2h、4h、8h、24h及48h和后处理组最后一次注射后O．5h、1h、2h、4h、8h的热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值；为观察P13K抑制剂对epbrinBl一Fc引起的脊髓背角神经元Fos蛋白表达的影响，P13K抑制剂womnallllillO．4p∥10山和LY2940025鹇／10pl预处理30min或后处理30幽，检测最后一次注射后2h腰4

6、、5脊髓背角神经元Fos蛋白的表达。④为观察EphB受体是否参与福尔马林引起的中枢P13K的激活。在注射福尔马林(1％，10p1)前30分钟，鞘内注射EpllB受体阻断剂EphBl—Fc(0．5心，记录注射福尔马林后O～5mill和15～30min的累积舔足时间和缩足反应次数，蛋白电泳检测福尔马林注射后30min脊髓P13K和p．AKT表达，免疫组织化学方法检测2h后脊髓背角神经元Fos蛋白表达。⑤为观察EpllB受体是否参与神经病理性疼痛引起的中枢P13K的激活。EphB受体阻断剂EphBl一Fc(0．5pg)在ccI模型建立前后鞘内给药3次(CcI前1h，后1d，3d)(预处理)或

7、单次鞘内给药(CCI后5d)(后处理)，检测多次给药组CCI模型建立后1d、3d、5d、7d和单次给药组CCI模型建立后1d、3d、5d(给药后0．5h、Ill塑望奎堂堡主兰垡笙壅!奎塑茎1h、2h、4h、8h)、6d、7d的热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值，蛋白电泳检测多次给药组CCI模型建立后5d和单次给药组给药后2h脊髓P13K和p．AKT表达，免疫组织化学方法检测多次给药组ccI模型建立后5d和单次给药组给药后2h脊髓背角神经元Fos