mir-100调控plk1基因在膀胱癌中的生物学功能及膀胱癌尿液mirna标志物的筛选研究

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1、复旦大学博士学位论文miR--100调控PLK1基因在膀胱癌中的生物学功能及膀胱癌尿液miRNA标志物的筛选研究姓名：沈益君申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：叶定伟2012-04-08miR．100调控PLKl基闵在膀胱癌中的生物学功能及膀胱癌尿液miP．NA标志物的筛选研究复日J大学博士i垒窒miR一100调控PLKl基因在膀胱癌中的生物学功能及膀胱癌尿液miRNA标志物的筛选研究【中文摘要】膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，涉及大量基因表达、功能异常及多种信号通路的改变。目前，膀胱癌发生发展的分子遗传学

2、机制还很不清楚。近年来，microRNA(miRNA)在膀胱癌发生发展中的作用及意义受到了越来越多的关注。本论文探讨了miR一100及下游的靶基因PLKl在膀胱癌发生发展及侵袭转移中的生物学功能，对其相关的分子作用机制进行了较为深入的研究。此外，我们也筛选出了膀胱癌的尿液miRNA生物标志物，对发展新的膀胱癌临床无创性诊断的方法具有一定的参考价值。首先，我们通过膀胱癌组织及癌旁正常粘膜的miRNA表达谱芯片分析，发现miRNA下调可能是膀胱癌发生发展的重要机制。通过进一步的筛选和验证，我们揭示了miR一100在膀胱癌中普遍下调，

3、其表达水平与膀胱癌肿瘤分期、肿瘤分级和淋巴结转移相关。我们通过在体外过表达miR-100，发现其能够抑制膀胱癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力，并能调控膀胱癌的细胞周期，使细胞周期阻滞在G2／M期，并能促进细胞凋亡。通过进一步构建miR-100慢病毒过表达载体，我们发现其能在体内抑制肿瘤的生长，这个新发现阐释了膀胱癌发生发展侵袭转移的分子机制，为临床治疗膀胱癌提供了新的思路。其次，我们通过生物信息学方法预测了miR一100的靶基因，然后再经过生物学实验方法，我们确定了PLKl是膀胱癌中miR一100的靶基因。通过荧光定量RT—PCR，

4、WesternBlotting，免疫组化技术和荧光素酶报告基因的方法，我们发现了miR一100通过与PLKl基因mRNA3’UTR序列的不完全互补结合，抑制PLKl的翻译，从而在转录后水平调控PLKl蛋白的表达水平，膀胱癌组织中miR-100表达与PLKl蛋白表达呈现负相关。我们进一步使用PLKl抑制剂(BI2536)，发现PLKl直接参与了miR一100诱导的膀胱癌细胞增殖，迁移和侵袭过程，为BI2536针对PLKl靶点治疗膀胱癌提供了切实的理论依据。最后，我们建立了简单、易行、重复性好的尿液细胞外miRNA提取流程。通过膀胱

5、癌及对照正常人群的尿液miRNA表达谱分析，筛选出了一些在膀胱癌患者尿液中高表达的miRNA，并发现U6可以作为尿液miRNA荧光定量RT-PCR的内参基因。通过验-l-miR-100调控PLKI基因在膀胱癌中的生物学功能及膀胱癌尿液miRNA标志物的筛选研究复旦大学博士论文证20个尿液miRNA标志物，我们发现尿液miR一509—5p／miR一124比值显示了较高的准确性，可能是膀胱癌诊断的无创性生物标志物。综上所述，我们发现了miR一100在膀胱癌中普遍下调，其表达水平与膀胱癌肿瘤分期、肿瘤分级和淋巴结转移相关，过表达miR

6、-100能够抑制膀胱癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力，并能调控细胞周期，促进细胞凋亡和抑制膀胱肿瘤的生长。PLKl基因直接参与了miR-100诱导的膀胱癌细胞增殖，迁移和侵袭过程。尿液miR一509—5p／miR一124比值可能是膀胱癌诊断的无创性生物标志物。这些发现为膀胱癌的分子遗传学提供了一个新的视野，也为膀胱癌的临床诊断和治疗提供了新的途径。【关键词】膀胱癌，microRNA，Polo—Like激酶1，生物标志物【中图分类号】R737BiologicalFunctionsofPLKlregulatedbymiRl—。100an

7、dscreeningofurinebasedmicroRNhbiomarkerinbladdercancer[Abstract】Bladdercancerisoneofthemostcommonhumanmalignancies，anditspathogenesisiscomplex，involvinga1argenumberofgenes’expression，aberrantfunctionsandchangesinmultiplesignalingpathways．Atpresent，themoleculargenetic

8、sofdevelopmentandprogressionofbladdercancerisstillunclear．Inrecentyears，thepathologicalrelevanceandsignificanceofmicroRNAs(miRNAs)i