irf-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

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1、复旦大学博士学位论文IRF--2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响姓名：崔磊申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：靳大勇2012-04-02IRF-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响IRF．2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响中文摘要胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。虽然近年来诊断和治疗技术不断提高，但胰腺癌病人生存状况仍不容乐观，这与胰腺癌发病机制复杂，多种基因参与调控，缺少有效的治疗靶点等有关。干扰素调控因子2(Ⅱ心．2)是干扰素调控因子家族的一员，其功能涉及免疫调节和肿瘤的发生发展。已有的研究表明，干扰素调控因子2参与了乳腺癌

2、、黑色素瘤、食管癌等多种肿瘤的形成，但是其在胰腺癌中还未见系统性的功能研究。在本课题中，我们研究了IRF．2基因在胰腺癌中的功能，着重进行了以下四个部分的工作：(1)构建IRF．2基因RNA干扰的载体，并在胰腺癌细胞系中稳定沉默IRF．2的表达；(2)研究IRF．2对胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移等生物学特性的影响，并进一步阐述其机制；(3)探讨胰腺癌细胞IRF．2沉默以后对吉西他滨化疗敏感性的影响；(4)结合临床数据，探讨IRF．2在胰腺癌临床样本中的表达情况，并分析IRF．2的表达与病人临床病理指标及预后的关系。第一部分：IRF．2基因siRNA载体的构建目的：构建I

3、RF．2基因的siRNA载体，并检测其效果。方法：首先设计针对IRF．2mRNA不同位点的特异性siRNA序列，合成寡核苷酸，然后将其连接到pBS,hU6．1载体上；选择合适的酶切位点与慢病毒载体FGl2相连，琼脂糖电泳及测序鉴定。然后进行大肠杆菌转化，质粒大量抽提。获得的质粒，转染293T细胞进行病毒包装。最后用病毒感染胰腺癌细胞，检测干扰效果。结果：本实验成功构建连有IRF．2特异性siRNA序列的pBS,hU6．1载体；并成功将序列转移到FGl2慢病毒载体上。在包装病毒及感染胰腺癌细胞系后，用Westernblot检测，实验结果表明效果较好，成功构建了下调IRF．2表达

4、的MIAPaCa-2和PANC．1胰腺癌细胞株。结论：成功构建IRF．2siRNA载体，获得下调IRF．2表达的稳定胰腺癌细胞株。关键词：干扰素调控因子2：RNA干扰；胰腺癌IRF-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响第二部分沉默IRF．2对胰腺癌细胞生物学特性的影响目的：研究沉默IRF．2表达对胰腺癌细胞生长、增殖、侵袭、转移等的影响。方法：在得到稳定干扰IRF一2表达的胰腺癌细胞株后，通过MTT、BrdU掺入实验、结晶紫实验、软琼脂克隆形成实验、裸鼠体内成瘤实验、细胞迁移实验、裸鼠体内转移实验等检验胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移等生物学特点的变化，并且进

5、一步从细胞周期改变及细胞凋亡方面阐述其机制。结果：MTT实验、BrdU掺入实验、结晶紫实验结果证实沉默IRF．2的表达抑制细胞的生长、增殖能力(P

6、内转移实验发现下调IRF一2的表达对胰腺癌细胞系侵袭、转移没有明显影响。结论：下调IRF．2表达对于MIAPaCa．2和PANC．1胰腺癌细胞株的生长、增殖和成瘤能力有着明显的抑制作用，而这种作用是通过改变细胞周期和细胞凋亡来实现；但是下调IRF．2表达对于细胞侵袭、转移能力没有明显的影响。关键词：干扰素调控因子2；RNA干扰；生长和增殖；细胞周期；细胞凋亡第三部分沉默IRF-2对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响目的：探讨沉默IRF．2以后对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响。方法：MTT检测吉西他滨对胰腺癌细胞株PANC．1和MIAPaCa-2的半数有效剂量(IC50)，了解这两

7、种细胞对吉西他滨的化疗敏感程度，选取相对耐药的细胞进一步探讨沉默IRF．2表达对细胞吉西他滨的化疗敏感性的影响。MTT检测干扰IRF．2基因后细胞对吉西他滨敏感性的变化。结晶紫实验和裸鼠移植瘤模型检测干扰IRF．2后是否增强吉西他滨对体外细胞克隆形成及体内成瘤能力的抑制作用。流式细胞技术检测沉默IRF一2基因前后细胞周期和细胞凋亡情况，Westernblot检测与细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况，并探讨可能的机制。结果：PANC一1和MIAPaCa-2细胞中均表达IRF．2基因，在PANC．1细胞中高于