egfr靶向性腺病毒的构建及功能检测

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1、温州医学院硕士学位论文EGFR靶向性腺病毒的构建及功能检测姓名：曾丽华申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：张启瑜2012-05-24温州医学院硕士学位论文EGFR靶向性腺病毒载体的构建及功能检测中文摘要目的：本研究以sh蛆．foldon-ZEGFR；1907融合蛋白基因替换腺病毒包膜蛋白肋er基因，构建EGFR靶向性腺病毒骨架质粒pAdl907。通过观察病毒Adl907．CMV．EGFP所携带示踪蛋白(绿色荧光蛋白)在293A及293AEGFR细胞内表达情况鉴定其靶向功能。方法：1．shaft-foidon．ZEGFR；1907融合基因的构建(1)通过基因合成法

2、合成foldon-ZEGFR．1907基因；PCR技术从质粒pAd上扩增shaft基因。(2)应用重组PCR(recombinantPCR)技术连接shaft和foldon-ZEGFR：1907两个基因片段，获得shaft—foldon-ZEGFR．1907融合基因。2．构建EGFR靶向性腺病毒骨架质粒padl907(1)PCR技术从质粒pAd上扩增M1DNA片段，将Ml克隆入载体pShuRle．CMV上，获得载体pShuRle．CMV．M1。(2)PCR技术从质粒pAd上扩增M2DNA片段，将M2克隆入载体pShuale．CMV．M1上，获得载体pShuRle．C

3、MV．M1M2。(3)将shaft．foldon．ZEGFR：1907基因克隆入载体pShuRle．CMV．M1M2上，构建出载体pShuttle—CMV—M1907M2。(4)基因敲除腺病毒质粒pAd上fiber基因后，与质粒pShuRle．CMV．M11907M2上的M11907M2DNA片段连接，获得腺病毒骨架质粒pAdl907。3．靶向性腺病毒Adl907．CMV-EGFP靶向功能的鉴定(1)含绿色荧光蛋白的穿梭质粒pShuRle—CMV．EGFP的构建：PCR技术从质粒pTrack上获得绿色荧光蛋白(EGFP)基因，并将其克隆进质粒pShuRle．CMV上

4、获得pShuale．CMV．EGFP质粒。(2)pAdl907．CMV．EGFP的构建：应用细菌BJ5813内基因重组技术将pShuRle—CMV—EGFP质粒与病毒质粒pAdl907进行同源重组，获得重组质粒pAdl907一CMV．EGFP。(3)腺病毒Ad1907．CMV．EGFP的扩增：用iipofectamine2000将质粒pAdl907一CMV．EGFP转染入293AEGFR细胞内，扩增获得腺病毒Adl907．CMV．EGFP。2温州医学院硕士学位论文(4)用病毒Adl907．CMV．EGFP分别感染293AEoFR和293A细胞观察EGFP表达情况，鉴

5、定其靶向性。结果：1．shaft和foIdon-ZEGFR,1907两个基因成功融合。PCR鉴定融合基因与预期结果大小一致；测序结果显示融合基因无碱基突变、错配和移位等情况。2．构建了EGFR靶向性腺病毒骨架质粒pAdl907。测序结果显示pAdl907质粒含shaft．foldon-ZEGFR，1907融合基因，且shaft．foldon-ZEGFR；1907基因中ZEGFR．1907上的helixl、2和3无碱基突变。3．腺病毒Adl907．CMV．EGFP靶向性改变。荧光显微镜观察显示：在293AEGVR细胞内可见大量绿色荧光蛋白表达，表明Adl907．CMV

6、．EGFP病毒感染293AF粥FR细胞并在细胞内大量复制；在293A内隐约可见少量绿色荧光，表明Ad1907．EGFP病毒对293A细胞感染效率低。结论：1．以融合基因shaft和foldon-ZEGFR．1907替代包膜蛋白基因fiber的腺病毒能够在293AEGFR细胞内进行复制扩增，此基因改造不但没有影响病毒的复制和包装，而且改变腺病毒感染特性。2．靶向性腺病毒Adl907．CMV．EGFP与一般的腺病毒载体相比，具有细胞特异性强，安全性更高，能进行全身用药等特点。此研究为腺病毒载体的活体基因治疗提供进一步研究基础。关键词：EGFR靶向性腺病毒；fiber；s

7、haft．foldon-ZEGFR：1907温州医学院硕士学位论文ConstructionofEpidermalGrowthFactorReceptorAdenovirusvectorandtesteditsretargetedfunctionAbstractObjeeth,e：ConstructedanewadenovirusvectorpAd1907byalteringthecytomembraneproteinfiberofAdvectorthroughincorporationintoitscapsidofshaft—foldon-ZeoFR．1907，