eb病毒相关人永生化b淋巴细胞系和scid小鼠淋巴瘤模型的建立

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1、温州医学院硕士学位论文EB病毒相关人永生化B淋巴细胞系和SCID小鼠淋巴瘤模型的建立姓名：辜芳申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：罗晓明2012-05-27温州医学院硕士学位论文EB病毒相关人永生化B淋巴细胞系和SCID小鼠淋巴瘤模型的建立中文摘要研究背景：1964年Epstein和Barr从非洲儿童伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma，BL)组织中分离出一株可传代的淋巴母细胞系，并发现这株细胞含有类似病毒的颗粒，随后被命名为Epstein．Barr病毒(EBV)。EBV是一种特异性嗜淋巴细胞的疱疹病毒，属于Y疱疹病毒亚科的成员之一。1979年Rosen发现EBV在体外可直

2、接转化人B淋巴细胞，建立永生化的B淋巴细胞系(BLymphoblastoidcelllines，BLCLs)，到目前EBV与B细胞关系及所建立的BLCLs得到了广泛的研究和应用。BLCLs保存了个体原有的完整基因组，广泛用于生物学研究的各个领域，如免疫学，细胞与分子遗传学和EB病毒相关肿瘤的免疫治疗等。EBV广泛存在于人群中，是致人类肿瘤的病毒之一，血清学、流行病学及分子生物学研究成果皆表明EBV与多种肿瘤密切相关，寻找EBV感染的动物模型，建立EBV感染和诱发的肿瘤模型对于进一步确定EBV与人类恶性淋巴瘤的关系以及探讨其致瘤的分子机理具有重要的意义。B细胞是人体液免疫的主要效应细胞，

3、检测B细胞的特性，分析B细胞发育表面标志，了解B细胞不同分化阶段与疾病的关系，有助于探讨各种疾病的发病机理，并可为临床提供诊治相关疾病的治疗。那么利用EBV体外转化人B淋巴细胞建立BLCLs后注射入SCID鼠体内建立淋巴瘤模型具有重要的意义，为EB病毒相关肿瘤的发病机制打下了基础，为EB病毒相关肿瘤的诊断、治疗提供了较好的研究平厶口O目的：摸索建立BLCLs的实验条件，研究淋巴细胞、EBV、环孢菌素A(CyA)的浓度对EBV转化B淋巴细胞实验的影响，建立人BLCLs，并鉴定其生物学活性。利用人BLCLs在SCID小鼠皮下及腹腔建立淋巴瘤模型，并鉴定肿瘤组织学来源。方法：1．EB病毒相关

4、人永生化B淋巴细胞系的建立及鉴定(1)B95．8细胞系培养后获得EBV原液。(2)Ficoll密度梯度离心法分离脐血和外周血单个核细胞(cordbloodperipheralbloodmononuclearcells，PBMCs；cordbloodmononuclearcells，CBMCs)。(3)EBV原液与CBMCs或PBMCs混合培养建立人BLCLs。1温州医学院硕士学位论文(4)光学显微镜下观察BLCLs的形态特征。(5)流式细胞术测定BLCLs膜表面CDl9和CD23分子表达水平。2．EB病毒相关SCID小鼠淋巴瘤模型的建立及鉴定：2．1×107个BLCLs细胞／鼠的剂量对

5、SCID鼠进行腹腔和皮下注射。(1)将外周血来源的BLCLsl、BLCLs2、BLCLs3、BLCLsl．1、BLCLs2．2、BLCLs3．3六株细胞进行腹腔注射和皮下注射，接种在30只SCIDdx鼠腹腔和大腿皮下为感染组。(2)不经任何处理的SCID小鼠5只为空白组。(3)腹腔接种2．1×107个人PBMC(0．2m1)的SCIDdx鼠5只为对照组。(4)HE染色，显微镜下观察肿瘤细胞形态。(5)免疫组织化学法鉴定肿瘤细胞来源。结果：1．建立了人血来源的BLCLs。2．显微镜下见BLCLs，细胞聚集成团，悬浮或半贴壁生长。3．流式细胞仪检测转化8周后的B细胞表面标志CDl9+和CD

6、23+，比率分别为90．7％茅187．5％。4．流式细胞术检测转化8周后的BLCLs细胞周期，示G1期和S期细胞占84％，凋亡峰未见。5．建立了EBV相关SCID小鼠淋巴瘤模型。6．BLCLs在SCID小鼠皮下和体内的诱瘤率差异显著。结论：1．细胞转化实验中，B淋巴细胞浓度与EBV的浓度影响着转化的成败。CyA对转化至关重要。2．脐带血B细胞不是EBV转化建立永生细胞系的理想选择。3．BLCLs在体外培养增殖活跃。4．EBV相关BLCLs对SCID小鼠具有致瘤性。关键词：EB病毒；永生化B淋巴细胞系；SCID小鼠；淋巴瘤温州医学院硕士学位论文EstablishmentofHumanB—

7、CellLymphomasinSCIDMOUSEInducedbyBLymphoblastCellLineABSTRACTBACKGROUD：Epstein-Barrvirus(EBV)wasfirstseenincelllinesderivedfromBurkillSlymphoma(BL)in1964byEpsteinandBarr．EBVisahumangammaherpesvirus．SinceRosenfoundthisvirusco