cav3.1在盐酸利多卡因致sh-sy5y细胞损伤中的作用研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文Cav3．1在盐酸利多卡因致SH．SY5Y细胞损伤中的作用研究ResearchontheroleofCav3．1inSH—SY5YcellsinjuryinducedbyLidocaineHydrochloride课题来源：国家自然科学基金(No．81100831)广东省医学科研基金(No．B2011303)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员麻醉学文先杰徐世元教授古妙宁教授杨承祥教授黑子清教授招伟贤教授肖晓山教授施冲教授靳三庆教授论文评阅人屠伟峰教授李雅兰

2、教授余守章教授2012年04月28日广州博士学位论文C巩3．1在盐酸利多卡因致SH．SY5Y细胞损伤中的作用研究博士研究生：文先杰指导教师：徐世元教授摘要随着局部麻醉的广泛应用，局麻药的神经毒性损伤及全身毒性反应已引起人们的广泛关注。特别是局麻药所致的外周神经损伤，给病人生产生活带来明显不良影响。局麻药神经损伤的预防及其治疗成为临床麻醉中的重要课题。临床上，椎管内麻醉后，部分病人可出现短暂性神经病学综合征(transientneurologicalsyndrome，TNS)，表现为烧灼样、持续固定、痉挛性、放

3、射性疼痛的症状。部分患者甚至可发生严重的神经功能永久性损害如马尾综合征。一般认为，局麻药所致的神经损伤与其剂量、浓度及脊神经在局麻药中暴露的时间呈正相关。但对于局麻药诱导的神经损伤机制目前尚不明确，可能与多种因素有关。细胞内钙超载是局麻药神经损伤的重要机制之一。细胞外Ca2+可通过细胞膜上的电压依赖性与受体依赖性等Ca2+通道进入细胞内，激活细胞内钙依赖性酶，诱导细胞凋亡，产生神经损伤。同时，进入细胞内的Ca2+尚可诱发细胞内钙依赖性钙释放，使细胞内钙库释放大量Ca2+，进一步加重细胞内钙超载，最终导致细胞凋

4、亡，产生神经损伤。电压依赖性钙通道分为高电压依赖性钙通道(highvoltageactivatedcalciumchannel，HAV)和低电压依赖性钙通道(10wvoltageactivatedcalciumchannel，LAV)。Cavl和Car2属于HAV，包括L型，N型，P／Q型和R型。低电压依摘要赖性钙通道即T型钙通道则由Cav3编码，包括三种亚型(Cav3．1，Cav3．2，Cav3．3)，其在静息电位下(．65mV～．50mV)即可激活，且具有快速激活，缓慢失活的特点；同时，T型钙通道还具有“

5、窗口电流”，即在T型钙通道稳定激活曲线和稳定失活曲线之间有一相互重叠部分。HVA和LVA在慢性神经病理性疼痛中均有重要作用，与神经损伤有关。低电压依赖性钙通道即T型钙通道，是调节神经元兴奋性和神经递质分泌的重要启动子，也是调节细胞内钙信号的关键因素。目前关于T型钙通道在局麻药神经损伤中的作用尚不清楚。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen．activatedproteinkinases，p38MAPK)激活是局麻药神经损伤的另一重要途径，细胞外Ca2+进入细胞内，激活钙依赖的钙调蛋白酶(Ca+／cal

6、modulin—dependentproteinkinasetypeII，Ca2+／CaMKII)，进一步激活凋亡信号调节相关激酶1(Apoptosissignal-regulatingkinase1,ASKl)，诱导p38MAPK的激活，形成Ca2+／CaMKII．ASKl．p38MAPK通路，p38MAPK的激活则可诱导神经细胞发生不依赖于半胱胺酸蛋白酶蛋白(Caspase)的凋亡反应。本课题采用SH．SY5Y细胞体外培养模型，通过免疫印迹和real．timePCR等方法，鉴定SH．SY5Y细胞表面T型钙

7、通道各亚型的表达，并观察lOmM盐酸利多卡因处理24h后，SH．SY5Y细胞表面T型钙通道的表达变化；采用RNAi技术，构建T型钙通道低表达的SH．SY5Y细胞株，并观察抑制SH．SY5Y细胞表面T型钙通道表达后，能否减轻利多卡因对该细胞的损伤作用，并检测p38MAPK的表达，探讨T型钙通道是否通过激活p38MAPK产生细胞毒性损伤作用。第1章盐酸利多卡因对SH．SY5Y细胞表面Ca,,3．1表达的影响实验1T型钙通道在SH．SY5Y细胞上的表达目的通过免疫印迹和real．timePCR方法检测T型钙通道各亚

8、型(Ca,,3．1、II博士学位论文Car3．2、Car3．3)mRNA和蛋白质在SH．SY5Y细胞上的表达，鉴定SH．SY5Y细胞表面T型钙通道表达亚型。方法SH．SY5Y细胞体外培养，采用免疫印迹技术和real．timePCR技术，检测Cav3．1、Cav3．2和Cav3．3在SH．SY5Y细胞上的表达。将免疫印迹X胶片扫描，采用quantityone图像分析软件分析目标条带的吸光度值，以[3-