bmi1基因在喉鳞状细胞癌及肿瘤干细胞中的研究

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1、复旦大学博士学位论文BMI1基因在喉鳞状细胞癌及肿瘤干细胞中的研究姓名：陈慧申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：周梁2012-04-05复旦大学博士论文中文摘要BMll基因在喉鳞状细胞癌及肿瘤干细胞中的研究第一部分人喉鳞状细胞癌中BMTl基因的检测目的探讨人喉鳞状细胞癌标本中BMll基因的表达情况及BMll基因的表达与喉癌的临床分期与分型之间的关系。方法收集人喉鳞状细胞癌肿瘤标本和癌旁组织，免疫荧光染色法定性检测BMll基因在喉癌标本中的表达情况，Real．timePCR和WesternBlot从分子水平和蛋白水平定量比较BMll基因在喉癌标本与正常癌旁组织中的表达情况

2、，以及BMII的表达情况与临床分期与分型之间的关系。结果取得20例喉鳞状细胞癌标本和20例正常癌旁组织标本。其中1．2期喉癌标本6例，3．4期标本14例；声门型标本4例，声门上型标本16例。肿瘤组织进行BMll基因免疫荧光染色观察可见BMll基因普遍表达。Real．timePCR结果显示BMll在肿瘤标本中的表达明显高于癌旁组织(p

3、与肿瘤的临床分期有关，但是与肿瘤的分型无明显关系。【关键词】喉鳞状细胞癌；免疫荧光染色；Real．timePCR；WesternBlot中图分类号R739．656复旦大学博士论文第二部分BMI1基因对于人喉癌Hep-2细胞系的作用目的将Hep．2细胞与RNA干扰细胞进行比较，研究BMll基因对于人喉癌Hep．2细胞系的作用。方法构建慢病毒载体，shRNA干扰使喉癌Hep．2细胞系的BMll基因表达下调。正常培养Hep．2细胞和RNAi细胞于96孔板上，在1、3、5、7天观察生长状态并用CCK-8法测定细胞的增殖状态。用有限稀释法将培养在96孔板中的两种细胞制成单个细胞悬液并培养2

4、周，观察克隆形成能力并与固定测量框比较计算面积比。将Hep．2细胞与RNAi细胞培养后用TUNEL和FITC．AnnexinV染色，比较细胞凋亡能力。PI染色后用流式细胞仪比较两种细胞的周期分布情况。两种细胞培养后接受剂量为20y、4Gy和8Gy的X射线放疗，48小时后以CCK-8法测吸光度值并计算抑制率，比较对放疗的耐受性。两种细胞中加入3lag／mL，6pg／mL和12ug／mE的顺铂注射液，培养24小时后以CCK一8法比较对化疗的耐受性。将1×105的Hep一2和RNAi细胞分别注入10只NOD／SCID小鼠的腋窝皮下，8周后观察成瘤情况，比较两组细胞的致瘤能力。结果shR

5、NA干扰使BMll表达下调，干扰效率为83．75％。Hep．2细胞和RNAi细胞培养1周后测吸光度值，可见从第三天起RNAi细胞的吸光度明显低于Hep．2细胞，并且有停止生长趋势。单个Hep．2和RNAi细胞在96孔板中培养2周后观察并用固定测量框比较面积比，可见RNAi细胞形成细胞球体积显著减小，面积比也降低(p

6、比例显著增高，S期和G2／M期的比例都显著降低。经2Gy、40y和8Gy的放疗后RNAi细胞对放疗的抑制性显著增加。经3ug／mL，6

7、lg／mL和12ug／mL的顺铂化疗后结果显示随着剂量的增加，RNAi细胞的抑制率在各个剂量都比Hep一2高。体内成瘤实验结果显示RNAi组形成的肿瘤体积明显减小，重量减轻(p<0．01)。结论BMll沉默能够抑制Hep．2细胞的增殖能力，促进期凋亡，促使细胞在G0／G1期聚集，减少对放化疗的耐受性，并且能够抑制体内成瘤能力。【关键词】RNA干扰；增殖；凋亡；成瘤；耐受性中图分类号R739．657复旦大学博士论文第三部分人喉癌Hep．2细胞系肿瘤

8、干细胞中BMll基因的检测目的探讨BMll与CDl33在喉癌标本中的共同表达情况以及BMll在CDl33+喉癌干细胞中的表达情况。方法BMll与CDl33在喉癌标本中进行免疫荧光染色，荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。流式细胞仪检测喉癌Hep．2细胞与RNAi细胞中CDl33+细胞率并进行分选。培养观察分选后的细胞，Real．timePCR定量检测两组细胞中CDl33的相对表达量，以及干细胞基因Notch2和PTEN的相对表达量。结果BMll和CDl33在喉癌标本中共同表达，其