乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的研究

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1、中文摘要谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase，GAD)是催化L·谷氨酸上的a-羧基进行脱羧反应的关键酶。GAD分布广泛，在自然界的植物、动物和微生物中都有它的存在。GAD极可能作为特定的诊断酶预测和区分糖尿病，所以深入了解它的结构和特性具有深刻的意义。GAD催化生成的产物GABA具有调节血压、促使精神安定和促进脑部血液循环等重要的功效，所以目前人们也在致力于开发富集GABA类的食品。本文研究了从黑龙江大学发酵工程实验室保存的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici1．2696)产生的GAD，对其培养基、培养条件进行了优化，通过细胞破碎、硫酸

2、铵盐析、SepharoseFastFlow离子交换层析、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析对GAD进行了分离纯化，利用比色法测定酶活力，用SDS．PAGE电泳法测定其纯度。GAD的纯化倍数为32．5，比活力达到81．25U／rag，回收率为15．1％。最后研究了GAD相关酶学性质。结果表明，乳酸片球菌产GAD的最佳发酵培养基配方为：L-谷氨酸的添加量为59／L，葡萄糖10g／L，酵母提取物20g／L，蛋白胨12．5g／L，无水乙酸钠2g／L，MgS04‘7H200．58g／L,MnS04。4H200．25g／L，NaCIO．01g／L，FeS04。7H200．001g／L，加蒸馏

3、水定容1000mL，调至pH6．5。最佳发酵条件：最佳接种量为4％，菌体的最佳培养温度为37℃，最佳发酵时间为16h。SDS．PAGE电泳后通过计算得到乳酸片球菌GAD的相对分子质量为70k。乳酸片球菌GAD的酶学性质结果：当底物L-MSG的浓度为100mmol／L时，GAD的活力达到最大。GAD的浓度为3．16％，最适温度为37"C，最适pH为5．0，PLP浓度为0．1mol／L时GAD酶活力最大。乳酸片球菌GAD的米氏常数Km=0．3658mmoi／L，最大反应速度Vmax--3．03I，tmol／L。黑龙江大学硕士学位论文关键词：谷氨酸脱羧酶(GAD)；Y-氨基丁酸(GABA)；

4、乳酸片球菌；分离纯化HAbstractGlutarnicaciddecarboxylase(CAD)isthekeyenzymeforcatalyzinga-carboxyltodecarboxylaseofL-MSG．Itiswidelydistributed，itexistsinplants，animalsandmicrogranismsofnature．GADismol'elikelyasspecialdiagnosticenzymeforforecastinganddistinguishingIDDM，SOitisverysignificativeforunderstandin

5、gitsstructureandcharacter．GABA，whichistheproductioncatalyzedbyGADhaseffectofregulatingbloodpressure，promotingnervestabilityandpromotingbrainbloodcirculation，SOpeoplea托devotingthemselvestodevelopfoodthatisGABAenrichment．ThistexthasresearchedGAD，whichispreservedbyfermentationengineeringlaboratoryo

6、fHeilongjianguniversity．IthasalsooptimizedtheculturemediumandtheconditionofcultivateofGAD，theseparationandpurificationbycelldiscmption，(NI-h)zS04andsaltprecipitation,SepharoseFastFlowion-exchangecolumnandSephadexG-"100．Then，ithasusedcolorimetrytOmeasuretheactivityofGAD，inthemeantime，italsohasuse

7、dSDS·PAGEtomeasurethepunityofGAD．PurificationfoIdofGADis32．5，specificactivityofGADis81．25U／mgandrecoveryis15．1％．AtlastthistexthasintroducedthemainpropertiesofGAD．TheoptimumfermentationmediumofGAD，isTheadditionamountofL—MSGis