妇幼保健院检验科-产前诊断操作规程sop文件

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2、转移到1.5mL离心管后，8000rpm离心5分钟，用微量移液器小心吸走部分上清，保留50piL的沉淀，加入125pL充分摇匀的变性液,充分混匀后室温放置5分钟。3、8000rpm离心5秒钟，弃去上清，将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。在沉淀中加150nL洗涤液I,旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗涤3次。4、在沉淀中加250gL洗涤液II,旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。共洗2次。5、最后在沉淀中加

3、250pL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。6、沉淀置于真空旋转干燥仪中干燥约5-10分钟或者56°C干燥箱中干燥20分钟以上，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入50yL溶解液并混匀。离心管置于56°C保温10分钟。8000rpm离心5秒钟，将含有基因组DNA的上清液移到一支新的离心管中。7、注：变性液使用前必须充分摇匀；乙醇必须干燥完全,有机溶剂抑制PCR扩增（四）PCR扩增操作流程1＞所需物品和设备设备：离心机.微量移液器（100071,200?1,50?1，10?1）、PCR扩增仪.

4、超净工作台材料：PCR扩增管、已灭菌的移液器吸头（1000?1，200?1，10?1）、PCR反应液、一次性手套、一次性吸水纸，冰盒或冰袋、专用工作服和工作鞋、专用办公用品等。2、PCR前准备2.1＞在PCR扩增仪上设定所要使用的PCR扩增程序2.2＞穿PCR实验室专用工作服，带一次性手套；确保超净工作台内有PCR专用移液器、移液器吸头.标记笔及离心管架;2.3.用75%的酒精擦拭超净工作台及PCR所用到的移液器、离心管架等物品，并放入超净工作台中，开启紫外照射30分钟杀菌（这些物品均为PCR专用，放在超净工作台内）;2.4.将30mll0%次氯酸钠加入放在超净台内的废液

5、缸中;（注意：如果在操作过程中凡是涉及到移液器碰到废液缸的情况，均需要使用75%的酒精重新擦拭移液器）；2.5＞从冰箱中取出提取的样本DNA,平衡到室温。3、实验操作步骤（所有过程应在PCR工作间中完成）3.1＞关闭紫外灯，使用75%的酒精对手套进行消毒，手伸入超净台内开始下一步操作3・2、从试剂盒中取出X+1个PCR管（X二样本数目，1为阴性对照，即蒸馅水），8000rpm离心5s・放在管架上，在管盖上标注样本编号。3.3、取出DNA样本及对照品，放入离心机中点动离心，取出后按照PCR管次序顺序摆放，放在管架上;3.4、将放有DNA样本的管架放入超净工作台（样本处理区）

6、内，使用75%的酒精对手套进行消毒后，手伸入超净台内开始下一步操作;3.5＞打开第一个PCRmix管的管盖，从冰上取出阴性对照管（蒸馅水），吸取4卩1阴性对照加入PCR管中，然后滴加一滴石蜡油，盖上PCR管将阴性对照管（蒸馅水）放回冰上;3.6、垂直将吸头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中,确保移液器前端没有碰到废液缸口;3.7打开第二个PCR的管盖，从管架上拿出与PCR管编号相同的DNA样本管，吸取4jil加入PCR管中，然后滴加一滴石蜡油，盖上PCR管盖，垂直将吸头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，确保移液器前端没有碰到废液缸口;（将DNA样本管放回放有DNA样

7、本的管架上，但确保摆放位置与还没有加样的DNA样本管有区别）；3.8、重复步骤7,直到DNA样本加完。对比PCR管的排列及DNA样本管的排列，确保样本加样无误;3.9、确定加样操作完成后，将所有的PCR管，放入离心机点动离心;3.10.将阴性（蒸馅水）对照管放入・20°C冰箱保存;3.11＞从离心机中取出PCR管小心轻放在管架上，脱去PCR加样用手套，换PCR扩增室专用衣服，进入PCR扩增区。3.12.将装有样本的PCR反应管放入PCR扩增区中的PCR扩增仪中，设定扩增程序,开始PCR反应，具体程序如下:94°C5min60s