pcr技术的种类及应用_生物学_自然科学_专业资料

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1、PCR技术的发展及应用平骏14112822276摘要：聚合解链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是1985年山美国PE-Cetus公司的科学家KaryBanksMullis发明的--种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展,现如今PCR技术在生命科学研究以及和关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应纽份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起來的相关技术作简要综述。关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代

2、初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划吋代意义的聚合酶链反应0。这项新技术是根据牛物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在矩时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果町靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响〔冈。发明人KaryBanksMulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。1、PCR技术的

3、原理［切PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核昔酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下DNA聚合酶将脱氧单核莒酸加到引物3,・OH末端，并以此为起始点，沿模板5,-3'方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性-退火-＞延伸。PCR反应的基本成分包括：模板DNA（待扩増DNA）、弓

4、物、4种脱氧核井酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，

5、乂都可作为下一•循环中的模板。PCR合成的特定的DNA序列产量随着循坏次数呈指数增加，每完成一次循环2-4min,2・3h就能将冃的棊因扩增，从而达到迅速大量扩增的FI的。2、PCR技术的反应组份2.1模板DNAPCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA,可以是基因组DNA或cDNA,mRNA也能作为PCR的模板，只需用逆转录酶把mRNA逆转录为cDNA即可。模板量的多少及其纯度的高低，是PCR成败与否的关键因素Z—⑹。由于PCR反应的特异性由寡聚核廿酸引物决定，模板DNA不需要高度纯化，但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制

6、剂、能结合DNA的蛋口质及多糖类物质的污染［岡。PCR所需模板DNA的量极微（通常在纳克级范围内），通常适宜的模板DNA浓度为30-50ng,不到1纳克的基因组DNA序列就足以用来进行PCR分析，甚至用1个DNA分子就能扩增出特定的DNA序列。ACTGAGFgaem▼当温度降低到55弋左右时.引物将退火到特定区域A・变性;B・退火;C■延伸图1PCR原理（摘自邓小红等.2007）2.2引物弓I物是PCR特异性反应的关键，PCR引物是一段与待扩增DNA序列互补的寡核廿酸片段，长度人多为10・30个碱基。一般情况下，一对引物包含5•端与正义链互

7、补的寡核井酸片段和3•端与反义链互补的寡核昔酸片段，这两个寡核昔酸片段在模板DNA上的结合位置Z间的距离决定PCR扩增片段的长度。PCR反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA序列必须是己知的，设计引物时尽可能的选择碱基随机分布的序列，尽最避免多嚓吟、多聚咗呢或其他异常序列。避免引物白身形成发夹结构等二级结构，尤其是两个引物Z间不应存在互补序列，尤其是在引物的3•末端，即使无法避免，其歹端的互补碱基也不能多于2个，以减少“引物二聚体”的形成。否则会影响靶DNA序列的扩增。在合成新链时，DNA聚合酶将单核昔酸添

8、加到引物的丁末端，因此引物孑端的5・6个碱基与靶DNA片段的配对必须精确、严格。两个引物中G+C碱基对的百分比(G+C%)应尽最相似，若待扩增序列中GC含最己知时，引物的GC含最则应与其类似。一般情况卜"，设计引物I寸,G+C碱基对含量以40%-60%为住，解链温度(meltingtemperature,Tm)应高于55°C。2.3DNA聚合酶最初的DNA聚合酚是从大肠杆菌中提取得到的DNA聚合酚1的Klenow片段。该片段具冇DNA聚合酶活性和3'5的外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核井酸。但是它有一-个

9、缺点，即Klenow片段对热很敏感，DNA的变性温度就可以使酶失去活性，因此在PCR的变性步骤之后都必须重新添加聚合酶，否则实验无法继续进行，这样增加了PCR操作的繁琐程度，而口