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1、PCR技术的种类及其应用1PCR技术的基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2 PCR技术的种类2.1反向PCR(InversePCR,IPCR)技术原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶
2、消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的
3、未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。2.2 锚定PCR(AnchoredPCR,APCR)技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。应用：它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。2.3 不对称PCR(asymmetricPCR)技术两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50～100÷1比例。在最初的10～15
4、个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。2.4 反转录PCR(reversetranscription,RT-PCR)技术当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT-PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。2.5 修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目的,如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等,可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序
5、列分析结合位点等。2.6 巢式PCR(NESTPCR)技术先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤
6、,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR(drop-in,drop-outPCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。2.7 等位基因特异性PCR(Allele-specificPCR,ASPCR)技术ASPCR依赖于引物3’-端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。2.8 单链构型多态性PCR(single-strandconformationalpolymorphismPCR,SSCPP
7、CR)技术SSCP-PCR是根据形成不同构象的等长DNAyearsmortgagehousing;4.mortgageregistrationformalitiesarecompleted.(D)pledge1.borrower(includingthepledgor)between18-65yearsofage,withfullcivilcapacity;2.collateral单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单
8、链所形成的空间构象,相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时,每条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存
