两型tnf-α对荷瘤小鼠mdsc免疫抑制功能影响

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1、华中科技大学博士学位论文中文摘要髓系来源抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs)是未分化成熟的、异质性的、具有免疫抑制功能的髓系细胞群体。肿瘤组织中被证实有MDSC的大量聚集，该群细胞通过抑制肿瘤免疫，而促进肿瘤的发生和发展。多种肿瘤组织来源的炎性因子如IL-1β、IL-6、PGE2、VEGF等参与MDSC的诱导和募集，肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF-α）作为促炎细胞因子，在肿瘤微环境中，被广泛表达于肿瘤相关巨噬细胞（TAM)、肿瘤细胞和肿瘤间质细胞，在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。但迄今为止，TNF-α对MDS

2、Cs的影响尚不清楚。本研究旨在探讨跨膜型和分泌型TNF-α（tmTNF-α和sTNF-α）对肿瘤MDSC免疫抑制功能的影响及其分子机制，为肿瘤治疗提供新线索。主要结果如下：第一部体外两型TNF-α对荷瘤小鼠MDSCs功能的影响用Percoll密度梯度离心法和Gr-1抗体包被的磁珠分离纯化荷瘤小鼠脾脏细胞的MDSCs，经流式细胞术鉴定其纯度达95%以上。一、荷瘤小鼠MDSC自身TNF-α和TNFR的表达用RT-PCR的方法和流式细胞术分别从mRNA水平和蛋白质水平检测MDSC自身TNF-α和TNFR的表达。结果表明：无论在mRNA水平还是在蛋白质水平，荷瘤小鼠MDSCs表达的TNF-α和两

3、型TNFR均明显高于正常小鼠的MDSCs（p<0.05），且以TNFR2表达为主。二、体外两型TNF-α对荷瘤小鼠MDSCs功能的影响1．外源性tmTNF-α促进MDSCs转录iNOSmRNA及分泌NO：用两型TNF-α刺激荷瘤小鼠MDSCs16h，结果显示sTNF-α明显抑制MDSC转录iNOSmRNA和分泌NO（p<0.05），而tmTNF-α则明显促进MDSC转录iNOSmRNA（约1.6倍）和释放NO（约2.5倍）。当用抗体中和tmTNF-α后，iNOSmRNA和NO的水平恢复至对照的基础水平。2．两型TNF-α均可促进MDSCs转录ARG1mRNA：采用real-timePCR

4、技术观察两型TNF-α对MDSCs转录ARG1mRNA的影响，结果显示：sTNF-α明显增加MDSCs3华中科技大学博士学位论文的ARG1mRNA水平（约4倍）（P<0.05），而tmTNF-α则轻度提高ARG1mRNA水平（约1.5倍）。3．两型TNF-α对MDSCs分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的影响：采用ELISA法比较两型TNF-α对MDSCs分泌IL-10和TGF-β的影响。结果显示：tmTNF-α可明显促进MDSC分泌IL-10和TGF-β（P<0.01），而sTNF-α则仅能刺激MDSC分泌TGF-β，对其产生IL-10则无影响。4．tmTNF-α可促进MDSCs

5、抑制T细胞增殖由于tmTNF-α对MDSC的刺激作用明显高于sTNF-α，故我们进一步观察用tmTNF-α刺激MDSCs的培养上清是否能够有效抑制PMA和Ionomycin联合诱导的T细胞增殖。结果显示：MDSC培养上清可明显抑制T细胞增殖（抑制率50%），而经tmTNF-α刺激的MDSCs培养上清的抑制作用明显增强（抑制率80%），该促进作用可被TNF抗体或IL-10抗体完全阻断。该结果充分提示：tmTNF-α能通过促进MDSCs分泌IL-10等抑制性细胞因子，增强MDSCs对T细胞增殖的抑制作用。三、tmTNF-α促进MDSCs发挥免疫抑制作用的分子机制1．tmTNF-α通过诱导p3

6、8磷酸化促进MDSCs的抑制功能：用Westernblotting观察两型TNF-α对荷瘤小鼠MDSCs的MAPK家族中信号分子的影响。结果显示：两型TNF-α对MDSC的ERK和JNK磷酸化水平均无明显影响，但可促进p38磷酸化，其中tmTNF-α的刺激作用明显强于sTNF-α，用抗体中和tmTNF-α可完全阻断其作用。提示tmTNF-α对MDSC的促进作用可能与p38通路相关。用p38特异性抑制剂SB203580预处理MDSCs，可完全阻断tmTNF-α对p38磷酸化的刺激作用，进而封闭tmTNF-α对MDSC分泌IL-10及抑制T细胞增殖的促进作用。2．tmTNF-α通过诱导NF-

7、κB活化增强MDSCs的免疫抑制作用由于tmTNF-α可促进iNOSmRNA的转录，而该基因是NF-κB的靶基因。因此，我们进而观察两型TNF-α对荷瘤小鼠MDSCs的NF-κB活化的影响。结果显示：两型TNF-α对NF-κB活化均有促进作用，但tmTNF-α的作用强于sTNF-α，即tmTNF-α可明显促进MDSC的IκBα降解和NF-κBp65的核转位；用抗体中和tmTNF-α可完全阻4华中科技大学博士学位论文断该分子的促进作用