喹赛多对大肠杆菌抗菌作用的研究

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1、喹赛多对大肠杆菌的抗菌作用研究专业：兽医药理学与毒理学2011届硕士研究生：张宏飞指导老师：王玉莲副教授(国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室，华中农业大学中国武汉430070)摘要喹赛多是新一代喹噫啉类的抗菌促生长药物，因其抗菌促生长作用显著、毒副作用低、使用范围广而倍受关注，关于喹赛多的抗菌机理目前还没有研究。通过对喹赛多抗菌机理的研究有助于进一步阐明喹噫啉类药物的抗菌作用方式，加快喹噫啉类药物的研发速度，为喹嗯啉类药物的合理、安全使用提供理论依据。本实验选取对喹赛多最敏感的大肠杆菌C84010

2、作为实验菌种，研究表明，喹噫啉类药物作用于细菌后可以损伤细菌的DNA并抑制DNA的合成，具有显著的厌氧选择活性，并在细菌内还原活化产生自由基。目前尚未确定喹嗯啉类药物在抗菌作用中所产生的自由基种类，其是否有作用靶点尚不清楚。本实验将分别在有氧和厌氧条件下对喹赛多作用大肠杆菌后细菌内产生的自由基进行检测，研究各种自由基在喹赛多抗菌过程中的作用，并对药物作用后细菌的形态变化和DNA损伤进行研究，找到喹赛多作用的主要方式和靶点。药物与受体的结合是药物的作用方式之一，大肠杆菌内是否存在喹赛多抗菌作用的受体目前还没有研究，本实验将采用放射性

3、标记的方法对大肠杆菌内是否存在喹赛多作用受体进行研究。1．自由基在喹赛多抗菌作用中的功能研究本实验将分别在有氧和厌氧条件下对喹赛多及其代谢物的抗菌活性进行研究，并对喹赛多代谢过程中产生的自由基进行检测，确定自由基在其抗菌过程中的作用。并对喹赛多作用后细菌的DNA损伤进行研究，确定自由基和DNA损伤的关系，同时实验将对喹赛多作用后细菌细胞膜损伤和形态学变化进行研究。喹赛多(CYA)在厌氧条件下对大肠杆菌C84010的MIC和MBC分别为1、4斗g／ml，在有氧条件下的MIC和MBC分别为16、1281．tg／ml，这说明喹赛多和其他

4、喹嗯啉类药物一样具有明显的厌氧选择活性。对其代谢物Cyl0、Cy2、Cyl、Cyl7、CY6的MIC测定发现，只有代谢物Cyl7(MIC=11．tg／m1)具有抗菌活性，而两种脱一氧产物(CYIO、CY2)和一种脱二氧产物(CYl)都没有抗菌活性，这说明喹赛多1和4号位上的N一0基团是喹赛多抗菌作用的必要条件。在有氧条件下，在喹赛多处理的细菌培养基上清液中检测到华中农业大学2012届硕士研究生学位论文了CYA、CYl0、CY2，没有检测到CYl；在厌氧条件下，培养基上清液中检测到了CYA、CYl0、CY2、CYl；无论是在有氧或是

5、厌氧条件下都在细菌体内检测到了CYA、CYl0、CY2、CYl。这说明无论在有氧还是厌氧条件下，喹赛多都可以进入细菌内发生脱氧代谢产生脱一氧和脱二氧代谢产物。在厌氧条件下，经0．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多作用后的细菌内均有一定量的ROS产生，其产生量随着药物浓度的增加而增加，在1h时ROS的产生量达到最大。在有氧条件下，经O．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多处理的细菌内均有一定量的超氧自由基产生，其随着药物浓度和时间的增加显著上升，4h时超氧自由基的量可以达到Oh时的16倍左右。经有抗菌活性的代谢物Cyl7作用后细菌

6、体内产生了和喹赛多大致等量的超氧自由基，而其他代谢物(CYl0、CY2、CYl、CY6)作用后细菌内无超氧自由基产生。在厌氧条件下，经O．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多作用后细菌内并没有羟自由基的产生。在厌氧条件下，自由基清除剂甘露醇、硫脲、二甲亚砜、丙酮、B．巯基乙醇、乙醇、甲醇、叠氮化钠都可以一定程度抑制喹赛多的抗菌作用，这说明自由基在喹赛多抗菌过程中起到了很重要的作用。在有氧条件下，钛试剂对O．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多的抗菌作用都有较强的抑制作用，随着钛试剂浓度的增加抑制作用增强，这说明在有氧条件下超氧自由

7、基在喹赛多抗菌作用中发挥着很重要的作用。不同浓度喹赛多作用含质粒pUC．19的大肠杆菌2h后，细菌内质粒出现了明显的降解，降解作用随着时间的延长和药物浓度的增加逐渐增强。D．巯基乙醇和叠氮化钠可以显著的抑制喹赛多对质粒的损伤作用，这说明喹赛多很可能是以芳香族自由基的形式作用于DNA核糖上的C1位引起了DNA的降解。经O．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多作用后细菌的细胞膜并没有出现明显的损伤。通过扫描电镜观察在厌氧条件下喹赛多作用的细菌形态发现，经0．5MIC、MIC、MBC浓度的喹赛多作用O．5h后细菌的形态变化都不是很明显，

8、为正常的短杆菌状。在MIC浓度作用4h后，细菌明显变长；24h后，细菌呈现长条状；48h后，细菌出现了丝状，部分细菌出现了断裂、破碎、细胞质外泄等症状。这种细菌出现了变长、丝状的反应是细菌DNA受到损伤时的特有反应。2．喹赛多在细菌体内结合位点的研