羊梨形虫核糖体rna内转录间隔区序列的测定及反向线状印迹技术的建立

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1、新疆农业大学硕士学位论文羊梨形虫核糖体RNA内转录间隔区序列的测定及反向线状印迹技术的建立姓名：牛庆丽申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：殷宏;邱家祥20080601摘要羊梨形虫瘸(旧称羊焦虫瘸)是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴风斯科(Babesiidae)巴嫩斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的多种原虫寄生于羊的红细胞或网状态皮绥您蠹所写}起蕊一类惫液原虫病醛统称，}姿床以高熟、贫盘、黄潼、斑红蛋叁泵袋体表漭巴结翳大茺主要特征，严重对可弓{起动物死亡

2、。本瘸在我蓐分布广、危害严重，常誊给疫送躺养羊韭造成巨大损失。本研究利用实验室液氮保存的羊梨形虫瘸病原，包括2神(6株)羊的巴贝斯虫和2摊(2株)苹酶泰囊虫，采瘸棱耱嚣RNA盼两个蠹转交阔隔嚣(疆Sl察疆s2)基因缀区域煮5。8SrRNA基霪序列分析方法，对我国的新疆略什地区、河北承德以及甘肃省的临潭、宁县、天祝、麻当六个不同地区羊的巴贝斯虫和甘肃省的澜源、宁夏的隆德两个地区羊黎勒虫进行分子分类学及分子诊断研究。其主要研究维聚包括嚣个方落：l。窝窝实验室保存夔8撩羊梨形虫，提取蒸鞭蕴DNA，溅得ITSl。5，SS。

3、嚣82、ITSt、5。8S茅露ITS2序列，分别构建系统发生树，并进行同源性比较。结果显示我国羊的梨形虫可明显分为巴贝斯虫和泰勒虫两枝；其中，莫氏巴贝斯虫株之间的同源性明显高于新疆喀什株未定种巴贝斯虫。鬯贝斯虫的ITSl帮ITS2棱苷酸区段变异较大，零孛闻隧源洼分裂在19。7％．99。4％，河=

4、毫株、宁昙撩、{恣潭株、天祝撩褰赢当株翁墨贝囊虫都是囱盎簿震传撵觞，在遗传演纯过程孛羲亲缘关系较迓，阚源性比较高，在ITSl．5．8S，ITS2、ITSl和ITS2序列的骶统发生树上，共处一枝。新疆喀什株是由璃眼蜱属传播的

5、，被其它的一些巴贝斯虫隔开，独立占有～枝，可以认为是一个独立的种。5．8SrRNA较保守，秸阕曩源性在87，i冁一100％之阕，系统发生树上备穗巴爱斯虫酶分布与ITSl．5。8S-ITS2、ITSl帮ITS2系统发生橱基本一致。两种泰勒蛊之闻羲溺溪链魄较嘉，辩薯经溺得翡18SrRNA基透嚣羧裰儆，其ITSl和ITS2区段种间变爨较小，ITSl．5．8S。ITS2、ITSl、5．8S和ITS2序列的同源性分别为96．8％、96．4％、100％和95．2％。该结粜与18SrRNA基因序列分类方法基本符合。．2。在已经确

6、定的18SrRNA基阁V4裹变区段鲢基磕主，翻蘑反惠线状印迹杂交技术(硪国)离特吴性稳高敏惑链携特点，设诗了黎影蛊逯雳探锋和属静特异性搽针，爱RLB技零检测竣上8株苹椠形虑。所有种特异性探针都仅仅和它们各自的靶序列发生反应，无论是在不同呶种，还是不同种群之间都没有交叉反应，与绵羊／山羊基因组对照试验没有杂交信号。将两种羊巴贝斯虫(莫氏融贝斯虫辩墨燹惫虫未定种喀卡}栋)帮两种羊泰囊虫(基氏泰赣虫渭潺株，尤氏泰勒虫隆德株)基因缝经分毙光度计定量禚t00ng／ul，连续i0倍稀释i0一。i042，用RLB方法检测，结暴攫

7、示泰勤虫较苇暖贝斯熙的敏感性高，奠氏巴贝斯呶、巴贝斯虫未定种喀什株、吕氏泰勒虫和尤氏鼹贝斯虫的敏感性分别是0．01pg、O。lng、0．0001pg、O．1pg，吕氏泰勒虫的敏感性明爨离于尤氏泰勒虫。该方法还可以甩来鉴爰诊錾星菠泰囊虫窝尤氏泰勒蛊惑染。对117傍孽外样品检测，著与ELISA蠹渍检溅鄹PCR结果相比较，发现反向线状印迹的检出率明显高予ELISA和PCR。所建立的方法可用于羊梨形盥瘸的诊断和流行病学调查。关键谣梨形虫，巴委翳虫，泰勒虫，反怒线状窜迹杂交，分子分类王AbstractOvinepiropla

8、smosisiscausedbyApicomplexa，Piroplasmia，BabesiidaeBabesiaandTheileriidaeTheileria．Thediseaseisusuallycharacterizedbyfever,hemolyticanemia，hemoglobinuria，andevendeathinseverecase．ItiswidelydistributedinChina，andconsideredtobethemostfrequentandimportanttick-bomd

9、iseaseofsmallruminantsandresponsibleforvasteconomicloss。Inthisstudy,genomicDNAoftheetiologicalagents(6isolatesof2Babesiaspeciesand2isolatesof2Theileriaspecies)ofovinepiroplasmosisw