[小学教育]蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验及其比较

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1、蛋白质1•由于蛋白质分子屮含有共轨双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有-特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋口质定最测定。2.双缩脉反应biuretreaction：蛋口质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。在540nm波长处有最大吸收。可用于蛋口质的定性和定量检测。紫色络合物分子结构式在碱性溶液(NaOH)中，双缩服(H2NOC-NH-CONH2)能与铜离子(Cu2+)作用，形成紫色络合物(该物质的分子结构式见图)，该反应即双缩脓反应。女缩腺反应是肽和蛋白质所特冇的，而为氨基酸所没冇的一种颜色反应。一般分子中含冇两个氨基屮酪基(即肽键

2、：・CO・NH・)的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。注：除-CO-NH-有此反应外，(・CONH2・)、(-CH2-)、(-NH2-)、(-CS-CS-NH2)等基团亦有此反应。°—CHR—CHHjOH双缩脓反应的鉴定由于蛋白质分子屮含有很多与双缩脓结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液屮发生双缩腺反应，且颜色深浅与蛋口质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩腺法测定蛋白质的含量(借助分光光度计可减小误差)。双缩腺反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使用试剂价廉易得，操作简便，可测疋的范围为1〜10mg蛋白

3、质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋口质含量须在约0.5mg以上。双缩豚法的缺点是精确度低、所需样晶量大。T扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如Tris缓冲液，因为它们产主阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。配制双缩麻试剂的注意事项双缩腺试剂由NaOH溶液(O.lg/mL)和CuSO4溶液(O.Olg/mL)配制而成，配制比例为5:1。但是双缩腺试剂不用现配现用,这是与斐林试剂不同的地方Z-!蛋白质检测方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，使用于0.2-1.Omg氮，误差为±2%费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，

4、缩短时间至4个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用二氯乙酸沉淀蛋口质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间双缩服法灵敏度低，1-20mg中速20・30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸钱：Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似紫外吸收光法较为灵敏，50-100微克快速5-10分钟蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外光吸收各种卩票吟和各种核昔酸用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法灵敏度最高，仁5微克快速5/5分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中

5、与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色其Amax由465nm变为595nm强碱性缓冲液，TritonX-IOOSDS最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化Folin酚试剂法灵敏度高，＜5微克慢速40・60分钟双缩尿反应，磷钳酸•磷钩酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸讓，Tris缓冲液，廿氨酸，各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化氨基酸前三酮鉴别试验的反应方程式:0c70*'c=o<0h2oh200/0H/'OH+rcho+nh2+CO2oC-N=Cc〉'ooz+2H)O其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收

6、峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨棊酸定量分析方氨基酸与前三酗水合物共热，可生成蓝紫色化合物，法。脯氨酸为黄色化合物，谷内酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。糖分的鉴别实验1.Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若冇还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若冇非还原性低聚糖及多糖存在,则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力淡基，是述原糖，多糖和蔗糖没有述原性。斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件卜-与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，町用于鉴定可溶性还原糖的存在。CuS04+

7、2NaOH===Cu（OH）2+Na2SO42CH3（CH2OH）4CHO+2Cu（OH）2一（加热）一＞2CH3（CH2OH）4COOH+Cu2O（砖红色沉淀）+2H2O2.Molish试验牛药水浸液，加a■蔡酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与试类存在，则在二液血交界处出现紫红色环。0H20HoHOH.CU'-O*ho3s呼04紫红色复合物2.成D杀试验牛药的水浸液与盐酸苯胖液共热，只要有糖类成分存在，即牛成黄色的糖D杀结品。