蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验及其比较

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1、蛋白质1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。2.双缩脲反应biuretreaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。在540nm波长处有最大吸收。可用于蛋白质的定性和定量检测。　  紫色络合物分子结构式在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。　　双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应

2、。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。　　注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。双缩脲反应的鉴定　　由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。　　双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使

3、用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！蛋白质检测方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度

4、低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2%费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间双缩脲法灵敏度低，1-20mg中速20-30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似紫外吸收光法较为灵敏，50-100微克快速5-10分钟蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外光吸收各种嘌呤和各种核苷酸用于层析柱流出液

5、的检测，核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法灵敏度最高，1-5微克快速5-15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色其λmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液，TritonX-100SDS最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化Folin酚试剂法灵敏度高，<5微克慢速40-60分钟双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化氨基酸茚三酮鉴别试验的反应方程式：氨

6、基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸为黄色化合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。糖分的鉴别实验1.Fehling试验 生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应

7、，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。CuSO4+2NaOH=====Cu（OH）2+Na2SO42CH3(CH2OH)4CHO+2Cu(OH)2---（加热）--→2CH3(CH2OH)4COOH+Cu2O(砖红色沉淀)+2H2O在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：1.Molish试验 生药水浸液，加a-萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在二液面交界处出现紫红色环。紫红色复合物　　3.成脎试验 生药的水浸液与盐酸苯肼液共热，只

8、要有糖类成分存在，即生成黄色的糖脎结晶。镜检结晶，可视结晶的形状而