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1、固定化金属离子亲和层析应用的综述郭允澄摘要经过35年的发展，固定化金屈离子亲和层析(IMAC)已经发展成为普遍的蛋白质纯化技术。这个综述从讨论其机制和优点开始。它继续应用，包括纯化组氨酸标签蛋白，天然金屈结合蛋白和抗体。磷蛋白分离和蛋白质组学也被IMAC与质谱联用涵盖。最后，本综述涉及IMAC在生物制药行业的发展，局限性和考虑。关键词固定金属离子亲和层析；蛋白质；纯化；评论介绍固定化金属亲和层析的思想(IMAC),最初由Porath等人提出(1975),基于Zn(II),Cu(II),Ni(II)和Co(II)等过渡金
2、属离子的亲和力在水溶液中转向半胱氨酸，组氨酸和色氨酸。这被扩展到使用固定在载体上的金属离子来分离和纯化溶液中的蛋白质的设计。Porath等人(1975)使用亚氨基二乙酸(IDA)将金展离子I古I定在琼脂糖上。蛋白质可以通过蛋白质表面上暴露的某些氨基酸残基(如半胱氨酸，组氨酸和色氨酸)与金属离子配位点特异性结合。最有名的应用是组氨酸标记的融合蛋白的纯化。这种技术已成为从台式秤到工业规模的蛋白质纯化的重要工具。近来，IMAC在诸如四环素，唾诺酮，大环内酯类，B•内酰胺类和氨基糖昔类药物检测样品的预处理等其他领域的应用有所增
3、加(Takeda等，2010)；用于检测血清，尿液和组织屮生物标志物的预处理，用于诊断在表面增强激光解吸/电离中与质谱法相关的疾病(Felix等人，2011;Wu等人，2009)；并在质谱分析之前用IMAC富集磷蛋白(Sun等人，2005)。机制在IMAC中，蛋白质的吸附是基于位于蛋白质表面的固定化金属离子与电子给体基团之间的相互作用(Porath等人，1975)。包含Cu(II),Ni(ID,Zn(II),Co(II)和Fe(III)离子的过渡金属离子是最常用的金属离子。附着于色谱的螯合化合物中的电子给体原子(N,S
4、和O)支持体可以配位金属离子并产生金属螯合物。取决于所占据的配位键的数量，螯合化合物的范围从二齿到五齿配合物。保留的金属配位位点通常含有水或缓冲分子，并可以与蛋白质表面的电离基团进行交换。除了蛋白质的氨基末端之外，由于其侧链中的电子给休原子，一些氨基酸特别适用于结合。虽然大量的残基(包括Glu,Asp,Arg,Lys,Tyr,His,Cys和Met)可以参与结合过程，但IMAC中实际的蛋白质结合由组氨酸残基的可用性决定(Arnold1991;Sulkowski1989)。一般考虑许多蛋白质可以与金属离子形成复合物。可以
5、部署IMAC来纯化许多这些螯合配合物。形成的复合物的强度彼此不同，导致IMAC的高度特异性。在1MAC中使用的色谱吸附剂包含螯合配体通过连接体连接的载体。当加入金属离子时,它们将与螯合配体形成络合物。金属离子的一些配位部分保留与溶剂或蛋白质结合的自由基(Kagedal201l)o靶蛋白的洗脱可以通过使用(1)低pH缓冲液，(2)竞争性置换剂或(3)螯合剂来实现。经常使用具有低pH值(例如pH4.0)的洗脱缓冲液。组氨酸残基咪卩坐环的pKa约为6.0,当pH降至约4.0吋咪畔将被质子化。在这种条件下，质子化的咪卩坐环不会
6、与金属离子结合，然后它会被洗脱。在大约中性pH下咪醴的竞争性位移对于低pH敏感的蛋白质更适合。引入强力螯合剂如EDTA有助于洗脱靶蛋口。EDTA提取金属离子并破坏蛋口质和螯合配体之间的相互作用。因此，在下一次纯化Z前需要用金属离子对柱进行再充电(Chaga2001)o支持，螯合配体，金属离子已经开发了各种具有不同优点和局限性的IMAC支持。传统的支持基于软凝胶基质如琼脂糖。多糖，例如纤维素，具有生物相容性和准备活化的优点。然而，它们表现出低的机械强度，因此不能在高压系统中使用。相比之下，无机载体(如二氧化硅)具有极好的
7、机械性能，但具有不可逆非特界性吸附蛋白质的缺点。离子螯合配体与三齿配体相比，对金屈离子的亲和力较高，但由于失去一个配位点，蛋白质结合能力较差。这在五齿螯合配体中更为显着。它们可以占据Ni(II)离子的六个配位点中的五个，留下一个配位点来结合蛋白质。蛋白质与IMAC树脂的亲和力很大程度上依赖于参与协调的金属离子。在IDA螯合配体的情况下，不同金属离子的亲和力排列顺序如下：Cu(II)>Ni(II)>Zn(II)MCo(II)离子(Horvath和Nagydiosi1975)。对于四齿螯合配体,如次氮基三乙酸，它强烈螯合C
8、u(II)和Ni(II)离子。该基质适用于配位数为6的金属离子，具有与基质复合的四种价态和可用于与蛋白质可逆结合的两种价态(Hochuli等人，1987)。
9、古I定在IMAC基体上的金属离子的选择取决于应用。三价离子如Al(III),Ga(III)和Fe(III)离子(Andersson和Porath,1986;Muszynska
