表观遗传及遗传分析的新标准

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1、表观遗传及遗传分析的新标准®Pyrosequencing——测序与定量之相得益彰Sample&AssayTechnologies定量数据打开遗传研究的新视野测序技术的发展大大扩展了我们对于生物信息是如何被编码于DNA核苷酸序列中的了解。这种了解同时也引发了新的疑问：微妙的序列改变，特别是在非编码区域，有什么重大意义？调控元件的相互作用会在什么时候对基因的表达产生影响？非序列形式的信息——如我们通常所说的表观遗传信息——如何参与促进了发育编程和细胞分化？最后，这些问题的答案将以何种形式推进应用科学的发展？这些问题都是遗传研究的新视野

2、。研究人员正在揭开DNA的遗传和表观遗传修饰中所储存并遗传的新层次的生物信息。这一信息的鉴定需要同时兼具应用灵活性和可获得定量数据的新一代的研究工具。®®焦磷酸测序技术及QIAGENPyroMark产品通过将遗传变异的检测和定量整合到一个强大的系统中，焦磷酸测序及PyroMark平台比其它定向DNA短序列的分析方案更胜一筹。对于一系列应用而言，这意味着投入的费用和时间更少（图1）。焦磷酸测序的优势包括：■可定量等位基因，即使是低频率等位基因■可检测未知的序列变异■同一台仪器，甚至同一次运行的分析多功能性■内置的分析对照保证了数据的

3、准确性和可靠性■快速获得直接且明确无疑的序列数据■直观的软件，可进行强大的分析和用户设计分析表观遗传学兽医学群体研究植物遗传学在定量单个及多个相邻CpG位点灵敏检测多种病原体感染，在育对群体遗传结构进行统计学上可测序及定量区分纯合性，杂合性，的甲基化方面，有着无比优越的种项目中进行快速的基因分型。靠的定量，即使是病毒等快速变以及多倍体物种的不同杂合状态。性能。化的目标。药物遗传学法医学癌症研究进化研究从头测序和内置的对照利于新标法医学分子标记的测序及定量增开展各种分析的应用灵活性，以可靠的测序适用于系统发育比较，记的发现和验证。强

4、了物证鉴定试验的辨别能力，全面鉴定与疾病相关的遗传和表高检测灵敏度以追踪育种试验的特别是高度降解的DNA。观遗传因素。性状改变。图1.焦磷酸测序在不同研究领域的优势。2www.qiagen.com表观遗传及遗传分析的新标准03/2011焦磷酸测序反应级联卓越的试剂和灵敏的技术实现了对序列变异的定量步骤1扩增DNA片段，作为焦磷酸测序模板的一条链被生物素标记。经过变性处理，分离出生物素标记的单链PCR扩增子，并与测序引物杂交。步骤2杂交的引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（ATPsulfurylase）、荧光素酶（luci

5、ferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）以及底物腺苷5’酰硫酸（APS）和荧光素（luciferin）共同孵育。步骤3第一个三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）加到反应中。如果dNTP与模板链上的碱基互补，则DNA聚合酶催化其加在测序引物上。每个掺入事件伴随着焦磷酸（PPi）的释放，它的摩尔量与掺入的核苷酸相同。步骤4ATP硫酸化酶在腺苷5’酰硫酸（APS）存在的情况下将PPi转化成ATP。此ATP驱动荧光素酶介导的荧光素转化成氧化荧光素，并产生可见光，其数量与ATP的量成正比。荧光素酶催化反应所产生的光被电荷偶联装®置（

6、CCD）芯片所检测，在原始数据输出（Pyrogram）中可见一个峰。每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目成正比。ನᔯᦺଘЙ̖ၶЏζՁὋڙPyrogramڎ˖௬ᇧ˝ʶ˓ࢎ步骤5三磷酸腺苷双磷酸酶持续降解未掺入的核苷酸和ATP。当降解完成，另一个核苷酸加入到反应中。ನᔯᦺࣿѴ步骤6dNTP的加入是依次进行的。值得一提的是，脱氧腺苷α硫代三磷酸（dATPαS）被作为天然的脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，因为它能被DNA聚合酶高效使用，而不被荧光素酶识别。随着过程的延续，互补DNA链延伸，而核酸序列则根据Pyrogram图中的信号

7、峰来确定。ҪЙᄉನᔯᦺ图2.焦磷酸测序反应级联。表观遗传及遗传分析的新标准03/2011Sample&AssayTechnologies3定量表观遗传学DNA甲基化分析标准的甲基化分析方法只提供了定性或半定量的数据，在考量表观遗传DNA甲基化对细胞周期和代谢的影响方面时可能会导致得出不正确的结论。没有甲基化水平的定量，是不可能将生理功能相关的甲基化与背景甲基化区分开来的。焦磷酸测序通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率（图3和图4）有效解决了这种局限性。焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。这种方法的其他优势还

8、包括以结果的序列背景来提供内置的质量控制，以及可将结果与预期的甲基化水平进行比较的能力。亚硫酸氢盐处理的内置对照省去了人工评估未转化的DNA水平，并预防了假阳性甲基化检测，从而确保了结果的可靠性。这些特征让焦磷酸测序成为DNA甲基化分析的金标准。此