木糖一步产pha混合菌群的筛选、结构分析与人工合成

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘

2、。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要基于环境资源方面的考虑，利用微生物混合菌群以木糖为底物发酵生产PHA越来越受到人们的关注。混合菌群由于成员间的分工合作，能够承受较高的代谢负荷和具有较高的鲁棒性，在低值和复杂原料利用方面与纯培养微生物相比具有优势。木糖是木质纤维素中第二丰富的糖类，开展利用木糖发酵生产PHA的研究，可以为木质纤维素原料资源化奠定基础。传统的混合菌群合成PHA的三段式工艺过程较为繁琐，加之无法建立有效的筛选压力，造成运行周期长，底物转化率低，无法达到工业化的要求。针对上述问题，本课题以木糖为例，探究混

3、合菌群一步生产PHA的方法。首先以木糖为底物，使用饱食饥饿模式结合尼罗蓝染色的筛选方法进行木糖产PHA混合菌群的驯化，最终获得具有较强PHA合成能力的混菌体系。通过参数优化，发现该体系在温度为33℃、pH为8、木糖浓度为2.4g/L、碳氮比为160以及碳磷比为125时具有最大的PHA生产能力，最终积累的PHA占到了细胞干重的31%。继而通过DGGE分析了驯化过程中菌落结构的变化，阐明了混合菌群演变的过程，DGGE条带测序结果表明最终的稳定体系中主要存在γ-Proteobacteria、Cellvibriosp.、Unculturedbacterium和Pseudomonasputida等4种优

4、势微生物。为所筛选得到混合菌群的进一步优化奠定了基础。为深入研究体系中混合菌群间的相互作用关系，以驯化结束的混菌体系为样本，筛选得到γ-Proteobacteria、Cellvibriosp.、Pseudomonassp.、Enterobactercloacaesp.和Bacillussp.5种类型的微生物，但是由于不可纯培养等原因，体系中一些重要的具有PHA合成能力微生物无法分离得到，导致这些菌株混合后所形成混合菌群的PHA合成能力十分有限。继而研究尝试将一些优良的木糖利用基因和PHA合成基因导入到大肠杆菌等宿主细胞中构建基因工程菌株，从而构建利用木糖合成PHA的人工混合菌群，初步发酵结果显

5、示其具备一定的PHA合成能力，该方法为利用木糖为底物生产PHA以及研究混菌体系中细胞相互作用关系提供了新的思路。关键词：木糖、PHA、混合菌群、DGGE、人工合成、相互作用关系万方数据ABSTRACTTheproductionofPHAfromcellulosebyusingmixedculturesgainsmoreandmoreattention,basedontheconsiderationofenvironmentandresources.Xyloseisthesecondmostabundantcarbohydrateinlignocellulosematerials,ranking

6、onlysecondtoglucose,theresearchofPHAproductionfromwhichcouldlayasolidfoundationforreclamationofthecellulose-basedsubstrates.However,thetraditionalthree-stageprocessforPHAsynthesisbymixedculturesiscumbersome,coupledwiththelackageofeffectivescreeningpressure,whichcombinedresultinginalongrunningperioda

7、swellasalowsubstrateconversionrate.Thusitisunabletomeettherequirementsofindustrialization.Focusingontheproblem,thisstudytakesxyloseasanexampleforexploringdirectPHAproductionbymixedcultures.Takingxylos