石蜡包埋组织个体识别研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文石蜡包埋组织个体识别研究Individualidentificationofparaffin--embeddedtissue课题来源：广东省科技计划项目学位申请人吕晋导师姓名刘超教授专业名称法医学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院基础医学院2013年5月9日广州硕士学位论文石蜡包埋组织个体识别研究硕士研究生：吕晋指导教师：刘超教授摘要研究背景与目的从福尔马林固定、石蜡包埋组织内提取DNA一直以来都是一项困扰着众多研究人员的难题。甲醛作为常用固定液福尔马林的一个重要成分，可以引起核

2、酸大分子之间以及核酸与蛋白质之间的广泛交联，这一反应将会导致从组织内提取DNA十分困难。不仅如此，如果固定所用的固定液不是缓冲型中性福尔马林溶液，还将出现甲醛被氧化生成甲酸后，固定液的PH值大幅降低，有时甚至会出现PH小于1的情况。这种酸性的环境将会导致DNA链的断裂。这些作用都导致无法利用PCR扩增技术得到满意的DNA片段长度和含量，从而严重影响了分子生物学研究。尽管从福尔马林固定石蜡包埋组织提取DNA十分困难，但却不能忽视这些组织可能为基因遗传学等研究提供的信息。在世界各地的医院及病理研究所都储存着大量的固定组织，

3、它们常是唯一的致病相关基因研究重要的研究对象。正是因为如此，越来越多的学者开始研究如何从固定组织提取高质量DNA，并有一系列的相关论文逐渐发表。不容乐观的是，虽然相关性文章在不断增多，但是这些文章所提及的方法，能够达提取到高质量DNA的并不多。首先，因为研究目的不同，对目的基因要求不同，很难用同一的标准来判定提取DNA的质量；其次，虽然有些方法可以保证提取出的DNA含量，但是因为这些组织内的DNA多由于固定的原因而降解成较小的DNA片段，尽管含量可观，无法保证片段长度，这种方法仍是难以推广的。其实，影响固定组织内DNA

4、质量的因素有很多，大体可以分为：1．固定前因素，这就包括了组织的类型和大小，固定前它的腐败程度等等；2．固定因素，包括了选取何种固定液，摘要固定液的PH值，温度以及固定时间的长短等；3．固定后因素，例如固定后储存时间的长短和储存温度的高低等。面对如此多的影响因素，想要找到一种理想的提取方法还需进一步研究，并结合考虑样材的情况。福尔马林固定石蜡包埋组织被要求做个体识别和亲子鉴定的需求有增多趋势。而且这些组织大部分都是肿瘤组织，恶性肿瘤十分常见，恶性肿瘤组织中普遍存在着基因编码区或非编码区的变异，这种变异同样可以发生在法医

5、学检测常用的15个STR基因座中。因此，研究常见肿瘤组织STR变异性十分必要。短串联重复序歹IJ(STR)广泛存在于真核生物的基因组中，具有高度的多态性。因为其核心序列较小通常为2-6bp，重复次数通常为15．30次，所以其片段长度较小，PCR扩增结果稳定，加上STR基因座的高度多态性在基因传递过程中遵循孟德尔遗传规律，它的这些特点使得PCR-STR复合扩增检测技术成为法医学不可缺少的一项重要的技术手段。虽然，PCR．STR符合扩增技术在组织身源认定的案件中应用广泛，但是这样的检测技术是有其假设前提的，既同一个体的任何

6、组织的STR基因型都是完全一致的。当遇到的检材是肿瘤组织的时候，这样的假设前提便不再存在。已有研究发现，在肿瘤组织的基因组中，不论是编码区还是非编码区都有可能发生变异，这种现象在STR基因座内同样可以观察到。在肿瘤组织内的这种变异表现为杂合性丢失(10ssofheterozygosity，LOH)和微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)，这些改变都可能会对PCR．STR复合扩增检测造成影响，导致肿瘤组织与正常组织STR分型结果不一致。方法1．脱蜡方法1．1水浴加热脱蜡将组织样本放入

7、1．5mlEP管中，向管内加入1000ulTES(10mmol／LTris，1mmol／LEDTA，O．5％SDS，pH8．5)溶液，在接近石蜡熔点的温度(65℃)下水浴30min，然后以13000rpm离心1min，弃去液体；重复上述操作1次～2次，而后于室温下晾干备用。1．2微波加热脱蜡向装有组织切片的1．5mlEP管中加入200ul消化缓冲液硕士学位论文(50mmol／LTris，1mmol／LEDTA，0．5％Tween．20，pH8．5)，密封后，置于微波炉中加热lmin(时间视石蜡多少而定，但不宜过长)，而

8、后以13000rpm离心3min，弃去液体；如此重复4次，而后于室温下晾干备用。1．3二甲苯脱蜡向装有组织切片的EP管中加入1000ul二甲苯溶液，密封后放入摇床慢速摇荡1h，而后取下以13000rpm离心3min，弃去液体，重复操作一次；弃去液体，向装有组织切片的EP管中加入1000ul无水乙醇，密封后放入摇床，慢速摇荡3min