桑黄菌原生质体诱变育种及发酵工艺条件的研究

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1、桑黄菌原生质体诱变育种及发酵工艺条件的研究ProtoplastMutagenesisandFermentationOptimizationofPhellinuslinteus2013年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。2学位论文作者签名：年月日学位论文版权使用授

2、权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：年月日指导教师签名：年月日江苏大学硕士学位论文摘要桑黄(Phellin

3、uslinteus)是近年来引起研究者广泛关注的一种珍稀食药用真菌，所含有的生物活性成分如多糖、蛋白和多酚等在抗肿瘤、调节免疫力、降血糖等方面具有明显的效果。本文拟采用原生质体诱变技术，对野生桑黄菌PLW-II进行钴一60辐照处理，筛选生长性能优良的菌株；进而对其发酵培养基组成和发酵条件进行系统优化；最后通过在25L发酵罐上开展放大试验，建立桑黄发酵动力学模型。主要研究内容和所得结论如下：(1)采用原生质体钴．60辐照诱变方法，筛选桑黄发酵高产菌株。首先采用18SrDNA序列同源性分析法，经形态学和分子遗传学研究，鉴定野生桑黄菌株PLW-II为裂蹄木层孔菌(Phellinus

4、lintenus)。采用酶解法制备桑黄原生质体，再用钴一60射线诱变原生质体，计算诱变致死率，确定钻．60诱变剂量为100Gy，此时诱变致死率为75％。按照100Gv的诱变剂量进行诱变，筛选出平板中生长速度较快的10株变异株，经液体摇瓶发酵试验，筛选3株变异株JU7、JU8和JUlO，其菌丝体产量分别为9．9g／L、10．3g／I．和9．5g／L，比出发菌株分别高出3．1g／L、3．5g／帅2．7∥L。考察3株变异菌株的遗传稳定性，平板中连续传代培养5次，同时进行摇瓶发酵试验，测定液体发酵中菌丝生物量。实验表明，5次传代培养中，JU8的菌体生物量保持在10．O一10．4g／L

5、，遗传稳定性较好，因此选择JU8作为后续发酵试验菌株。(2)以菌体量为指标，利用单因素实验和Box．Behnken3x3设计优化桑黄PheUinuslinteusJU8深层发酵培养基组成。响应面分析结果表明，各因素对桑黄菌丝体量均存在显著的相关性；优化后的发酵培养基组成为：葡萄糖35．85g／L，麸皮16．52g／L，酵母膏3g／L，KH2P041．0g／L，在此条件下，菌丝生物量可达16．26g／L。最适培养条件为：培养温度30℃，摇床转速160r／min，接种量15％，装液量100mL／250mL，初始pH5．5，摇瓶培养8天。25L发酵罐放大试验结果表明，在发酵体积18

6、L，温度30℃，通气量O．8wmin，搅拌速度160r／min的条件下，发酵培养8d，菌体生物量可达18．8±1．21g／L。(3)在25L发酵罐上进行分批发酵试验，通过测定发酵过程中的桑黄菌体生物量、胞外多糖产量和残糖消耗量，建立了桑黄PhellinuslinteusJU8分批发酵动力学模型。根据菌株在25L发酵罐分批发酵过程中所表现出来的菌体生长、产物生成和底物消耗规桑黄菌原生质体诱变育种及发酵工艺条件的研究律，确定桑黄胞外多糖合成类型属于细胞生长部分偶联型。因此选择Logistic方程和Luedeking—Piret)rY程分别描述菌体生长动力学、产物生成动力学和底物消

7、耗动力学规律；利mOrigin8．0软件对其实验数据进行非线性拟合，得到相关动力学模型参数，从而获得相关发酵动力学模型。结果显示，桑黄分批发酵动力学模型拟合效果较好。关键字：桑黄，原生质体诱变，发酵优化，模型，动力学¨江苏大学硕士学位论文ABSTRACTPhellinuslinteushasattractedmanyresearchesinrecentyearsforitsbioactivecomponentsincludingpolysaccharides，proteins，andpolyphenol