硫酸铵分级沉淀

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1、一，基本原理   硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。二，试剂及仪器1.组织培养上清液、血清样品或腹水等2.硫酸铵（NH4）SO43.饱和硫酸铵溶液（SAS）

2、4.蒸馏水5.PBS(含0.2g/L叠氮钠)6.透析袋7.超速离心机8.pH计9.磁力搅拌器三，操作步骤  以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。  （一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）1.将767g（NH4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1mol/L,25°C）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20000′g离心

3、30min，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。（三）透析1.蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。四，应用提示（一）先用较低浓度

4、的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1.边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3.3000′g离心30min（4°C），保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐

5、析（硫酸氨用量参考表1）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+,SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类

6、似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入

7、硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回

8、到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100ml的硫酸铵百分比从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100ml变成107ml左右