人ifn-检测试剂盒（elispot法）说明书

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1、人IFN-检测试剂盒（ELISPOT法）说明书【产品名称】人IFN-检测试剂盒（ELISPOT法）【包装规格】96T/盒【预期用途】本试剂仅供科研使用，不适合用于临床检测。用于测定特定细胞样本中（例如PBMCs）分泌IFN-的细胞比例，从而测定细胞对于特定抗原的免疫响应。【IFN-简介】20世纪30年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时，发现普遍存在两种病毒相互拮抗的现象，由此产生了病毒间干扰现象的概念。1957年发现细胞与病毒一起培养后能产生一种可溶性因子，该因子能“干扰”病毒感染新的细胞，此因子被称为“干扰素”。此后证明干扰素（in

2、terferon，IFN）是由一族分泌蛋白质组成，对同种病毒具有广谱抗病毒活性，它存在于各种脊椎动物体内，平时细胞内含量很低，经病毒或其它干扰素诱导剂诱导后产量可以提高。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为3型，即I型、II型和III型干扰素。I型包括IFN-、、、、、、、等；II型干扰素由单基因家族IFN-构成，又称为免疫干扰素；III型干扰素是一种新发现的细胞因子，与I型干扰素关系密切，称为IFN-。-干扰素主要是由抗原、有丝分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T细胞及NK细胞所分泌的一类可溶性糖蛋

3、白。抗原、T细胞促分裂素（PHA、ConA）、细胞因子（IL-2、IL-12、IL-18、bFGF、PDGF、EGF）、葡萄球菌肠毒素B，均会诱导-干扰素的合成。【检验原理】机体被外来的病原感染后，会产生一系列的免疫应答反应，其中重要的一条免疫途径是细胞免疫。机体内的T细胞受到抗原的刺激致敏，产生效应T淋巴细胞，当这些T细胞再次受到相同抗原刺激时，会发生特异性免疫反应，分泌多种细胞因子如γ-干扰素。经适当分离、处理的细胞（如PBMCs）与相应刺激免疫原一起加入到预包被抗γ-干扰素抗体的PVDF膜微孔中，培养一段时间。若细胞被激活开始分泌γ-干扰素，局部（

4、在紧靠分泌细胞的周围）分泌出的γ-干扰素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。被捕获的γ-干扰素可进一步与辣根过氧化物酶偶联的抗γ-干扰素抗体特异性结合并使其滞留在PVDF薄膜表面，最后通过显色底物使其在反应部位形成不溶性斑点，每一个斑点代表一个分泌γ-干扰素的细胞，记数斑点数量可以获得被激活细胞的数量。并通过与总细胞数的比值，可以进一步计算在被激活细胞的频率。1/4【主要组成成分】1、试剂盒组分序号组分名称规格数量主要成分预包被细胞培养微孔由12×8孔的可拆卸板条组成，已包被1板96孔1块鼠抗（人IFN-抗体）人IFN-单克隆抗体2阴性质控1mL2瓶无抗原

5、的基质液3阳性质控1mL2瓶主要成分为植物凝集素PHA含有HRP标记的鼠抗人IFN-单克隆4酶标液（人IFN-）12mL1瓶抗体5浓缩洗涤液（10×）30mL1瓶主要成分为磷酸盐缓冲液AEC显色液A0.61瓶含过氧化氢6mL7AEC显色液B12mL1瓶含3-氨基-9-乙基咔唑8说明书/1份/注：不同批号试剂盒中各组分不能互换2、需要实验者自行准备的试剂与仪器•水平离心机（温控18~25℃，离心力不低于1800g）•II级生物安全柜或超净工作台•细胞计数设备：显微镜手工计数或自动血细胞计数仪计数•CO2细胞培养箱•微量移液器及配套加样枪头•1.5mLEP

6、管、15mL离心管•ELISPOT读板仪或体式显微镜、放大镜【储存条件及有效期】•试剂未启用于2~8℃：避光密封保存，有效期12个月。•试剂启用后于2~8℃：有效期14天。•生产日期：见标签。•有效期至：见标签。【操作步骤】注意：各试剂和板条使用前需室温平衡至少半小时，以便温度恢复至室温。1、每个测试样本需3孔（阴性对照（N）、检测孔（T）、阳性对照（P））或按照使用者实验安排。阴性对照（N）：每孔加入50μL阴性质控溶液。检测孔（T）：每孔加入50μL使用者待测的刺激物溶液。2/4阳性对照（P）：每孔加入50μL阳性质控溶液。6之后，以PBMCs为例，建

7、议每个检测孔加入100μL细胞浓度为2.5×10cell/mL的细胞悬液。其它种类细胞可以按使用者的实验计划进行。2、当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃，5%CO2培养箱，培养16~20小时。3、洗涤液：根据所需量，将10×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍，即为洗涤液。4、洗板：从培养箱取出培养板，倾倒孔内液体，洗涤液200μL/孔洗涤5次，每次30秒，最后一次，在吸水纸上扣干。5、酶标液孵育：每孔加入100μL酶标液，室温(18~30℃)孵育1hr。6、洗板：倾倒孔内液体，洗涤液200μL/孔洗涤5次，每次30秒，最后一次，在吸水纸上扣干。建议优化步

8、骤（可省略）：打开微孔板背面保护壳，洗PVDF膜反面一次可有效降低