ncogt和sogt糖供体底物特异性研究

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1、目录第一章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一节糖基化分类和糖基转移酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1糖基化分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2糖基转移酶分类及结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2第二节O．GlcNAc修饰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2．1O．GlcNAc糖基化特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．2O．GlcNAc修饰的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．3调节O．GlcNAc修饰的特征酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．4OGA结构及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2．5OGT结构及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一51．2．6O—GIcNAc修饰底物及分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．7O—GlcNAc修饰与蛋白活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．8O．GlcNAc修饰的生物学功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．2．

3、9O．GlcNAc修饰的病理学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l第三节研究内容及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第二章材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l5第一节2．1．12．1．22．1．32．1．42．1．5第二节2．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15菌株、基因及细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15化合物来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15主要实验试剂及耗材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16主要试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20外源表达ncOGT和sOGT蟹白及功能验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20V第一章前言2．2．2ncOGT和sOGT供体底物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．2．3细胞培养及化合物的可代谢性验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29第三章实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯35第一节外源表达ncOGT和sOGT蛋白及功能验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．1．1pET-28a．sOGT、PMAL．C2X-ncOGT重组质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．1．2sOGT蛋白的表达、纯化条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一363．1．3ncOGT蛋白的表达、纯化条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．1．4sOGT、ncOGT蛋白表达纯化的WesternBlot验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．1．5大肠杆菌中sOGT、ncOGT蛋白功能的验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯．383．1．6酶动力学常数研究：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-39第二节ncOGT和sOGT供体底物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41第三节细胞培养及化合物的可代谢性验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯433．3．1细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．443．3．2sOGT和ncOGT的细胞内功能验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯443．3．3nup62和myc蛋白细胞内表达的验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45第四章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、⋯⋯⋯⋯⋯⋯47第一节外源表达ncOGT和sOGT蛋白及功能验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47第二节ncOGT和sOGT供体底物的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一48第三节细胞培养及化合物的可代谢性验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．50第五章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．56V第一章前言糖类、蛋白质、

8、核酸是构成生物体的三类大分子物质。糖类除了供能和作为结构物质基础，还在细胞和蛋白质功能方面扮演着十分重要的角色。自然界中，细胞表面和很多生物大分子上都带有大量特异性糖链，这些多糖调节细胞与细胞、细胞与间质及细胞与大分子之间的识别和相互作用，从而影响细胞功能。细胞外还存在分泌的多糖物质，起粘附或润滑功能。细胞核和细胞质中很多蛋白质和多肽上有多糖连接连位点，可以调节蛋白质的合成、活性和稳定性，影响多条信