hif1α和vegf在胃癌中的表达与临床意义

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1、温州医学院硕士学位论文择手术方式提供有价值依据，而且有助于临床抗肿瘤治疗提供新思路、开辟新的途径，为阻断肿瘤侵袭和转移治疗提供新的靶点。温州医学院硕士学位论文材料和方法一．实验设计本研究采用免疫组化SP法检测60例胃癌组织以及20例胃溃疡组织、20例正常胃组织中的HIF一1a与与VEGF蛋白的表达。二．标本采集从1996—2000年我院收治的401例胃癌病例中选取60例术前未经过放疗、化疗并具有完整的l临床病理资料和回顾性随访资料的胃癌术后石蜡标本(恶性组)作为研究组。以及同时期手术的胃溃疡标本(良性组)20例、正常胃粘

2、膜组织标本(正常组)20ff0(为同批次胃溃疡的手术标本周边的『F常胃粘膜组织)设为对照组。三．试剂1．一抗：鼠抗人HIF一1d单克隆抗体、鼠抗人多克隆抗体VEGF，购自Neomarker公司。2．UltraSensitiveSP试剂盒(链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒)，购于福州迈新生物制品公司。该试剂盒的组成为，试剂A：即用型过氧化物酶阻断剂，试剂B：即用型阻断血清(10％正常动物非免疫血清)，试剂c：即用型生物素标记的第二抗体，试剂D：即用型链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶溶液。3．液体DAB酶底物

3、显色试剂盒，购于福州迈新生物制品技术开发公司。该试剂盒由A，B，C三种溶液组成。使用时，取0．9ml蒸馏水中加A，B，C溶液各一滴混匀，避光存放，30分钟内有效。4．多聚L赖氨酸溶液，购于福州迈新生物制品技术开发公司。它作为粘片剂用于处理玻片，防止组织从切片上脱落。使用时，取多聚一L一赖氨酸i份，蒸馏水9份，混合均匀。将充分洗净、预先干燥的玻片浸泡于稀释后的多聚L一赖氨酸溶液数十秒，捞出于室温下晾干或在45。C烤箱内烘干。处理后的玻片可长期保存使用。温州医学院硕士学位论文5．磷酸盐缓冲液(Phosphonatebuffe

4、rsolution，PBS)粉剂，购于福州迈新生物制品技术丌发公司。每袋用2000ml蒸馏水稀释后其浓度为0．OiM，调节pH至7．207．40。6．抗原修复液：柠檬酸抗原修复缓冲液粉剂，购于福州迈新生物制品技术丌发公司。每袋用2000ml蒸馏水稀释后其浓度为0．01M，调节pH至6．00。7．苏木精素溶液，用于DAB显色后的复染。8．其他如中性树胶、酒精、二甲苯、伊红等均为市售国产分析纯。四．主要仪器设备奥林巴斯生物显微镜(CX31RBSF，Olympus，Japan)病理组织漂烘处理仪(PHYm型，国产)LeiCa病

5、理切片机(RM3325，German)精密PH计(PHS一3C，上海雷磁仪器厂)微量移液器(20u，50u，国产)隔水式电热恒温培养箱(PYx一型，国产)电热鼓风干燥箱(CSl01—3型，国产)恒温培养箱(MIRl60／MIR260型，日本)载玻片(国产)盖玻片(国产)高压锅(浙江苏泊尔)电炉(浙江嘉兴市风桥电热器厂)图像采集系统图像分析软件Imageproplus5．02五．实验方法1．免疫组织化学技术S—P法原理：免疫组织化学是根据免疫学和组织化学原理，用特殊标记物标记抗体或抗原，通过抗原抗体反应在组织和细胞上进行的

6、一种化学反应，并利用化学反应所呈现的颜色，在原位上确定组织细胞结构的化学成分和化学性质。S-P法是其中一种染色方法，它采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。9温州医学院硕士学位论文2．实验步骤如下：2．1载玻片的处理：将预先经酸溶液和酒精浸泡、充分洗净的玻片干燥后，浸泡于稀释的多聚一L一赖氨酸溶液30一40秒，随后置于45。C烤箱内烘干。2．2组织切片的制作：将石蜡包埋的标本于切片机上切取5um厚的组织切片，放入60℃电热恒温培养箱中1小时，烘干后常温纯二甲

7、苯脱蜡2次，每次10分钟。2．3脱蜡后的切片依次置于浓度为100％、85％、80％、75％的系列酒精中逐级水化，然后用自来水冲洗至载玻片清洁透明，蒸馏水漂洗2次，每次1分钟。2．4用0．01MPBS(pH7．4)冲洗3次，每次3分钟。2．5每张切片滴加1滴(50u1)过氧化氢阻断液(试剂A)，蒸馏水冲洗2次，0．01MPBS冲洗2次，每次3分钟。2．6将切片放入盛有己煮沸的柠檬酸缓冲液的耐热容器中，继续加热至沸腾(100。C)，维持5分钟，取出容器置室温冷却20分钟，取出切片，蒸馏水沈2次，再用PBS漂洗3次，每次2分钟

8、。2．7每张切片滴加一滴非免疫性动物血清，室温下孵育20分钟。2．8滴加～抗(鼠抗人MIFla单克隆抗体、鼠抗人多克隆抗体VE6F浓缩液用PBS缓冲液按1：200稀释成的工作液)，每例标本分别滴加l滴第一抗体，阴性对照片则滴加1滴PBS液作为阴性对照。2．9室温下孵育60分钟，0．01MPBS冲洗3次，每次3分钟。2