cytophaga+hutchinsonii纤维素吸附突变株筛选与相关吸附蛋白的的研究

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1、纤维素的有效降解，而滑动性的增加有可能会增加菌体对纤维素的降解能力。通过紫外线诱变我们得到两株在琼脂培养基上生长扩散发生明显变化的菌株，但其在纤维素底物上的生长特征没有出现明显提高，具体原因有待进一步研究。通过转座子随机插入诱变得到几株突变株，但对其吸附、运动以及生长特性进行研究，均没有发现与野生型明显的差异。经质粒拯救得到其基因失活的座位，保守序列进行分析发现CHU0456含有一个FN3Superfamily结构域，而此结构域预测可能是与底物吸附相关的，但对其进行吸附性质研究时却没出现吸附现象，CH

2、U0456在基因组中发挥着怎样的功能，这有待于后续试验的进一步研究。2)Cytophagahutchinsonii膜相关蛋白提取方法的研究目前对膜蛋白的研究已经受到越来越多的关注。基因组序列分析表明，在Homosapiens，Escherichiacoli和Saccharomycescerevisae中有30％的编码蛋白质是膜整合蛋白。由于膜蛋白所具有的一些特有的性质如高疏水性，低丰度等，使其成为较难研究的对象之一。初步研究表明，Cytophagahutchinsonii对结晶纤维素的吸附降解极有可能

3、与其膜表面的酶(蛋白)有关，因此我们对其膜蛋白的提取方法进行了初步探索，包括总膜蛋白的提取以及膜蛋白的分级分离。结果表明，Cytophagahutchinsonii膜蛋白提取的最适去污剂为1％DDM。在4℃条件下处理3h可以释放最大量的膜蛋白，并通过实验表征了此两种方法的可行性。3)纤维素吸附膜相关蛋白的鉴定由于纤维素对吸附蛋白具有浓缩的作用，因此可以通过富集来鉴定与纤维素吸附相关的膜蛋白。通过将提取的葡萄糖培养外膜蛋白与纤维素混合进行吸附，随后SDS／PAGE电泳检测比较吸附前后富集的蛋白条带，发现

4、有6条蛋白条带发生浓缩，将这些蛋白条带进行质谱鉴定，得到4个富集蛋白。其中3个是是功能未知的蛋白，另外1个是与滑动相关的蛋白。对此滑动蛋白进行的异源表达尝试没有成功，可能是由于膜蛋白结构的特殊性使其难以表达。此外，为了比较吸附缺陷突变株与野生型膜相关蛋白的差异，通过SDS／PAGE电泳检测比较吸附缺陷突变株与野生型全膜蛋白与纤维素吸附之后相关差异膜蛋白。发现吸附缺陷突变株中有1条蛋白条带发生缺失，并在最上方出现一条明显的浓缩条带，将这些蛋白条带进行质谱鉴定，得到2个未知功能蛋山东大学硕士学位论文白。对

5、此缺失蛋白进行的异源表达尝试同样没有成功。4)不同碳源培养条件下膜相关蛋白的双向电泳分析Chutchinsonii需要吸附到纤维素底物上才可以完成对纤维素的降解，因此在以纤维素为碳源培养过程中，某些膜蛋白可能会得到大量表达，因此比较以纤维素及葡萄糖为碳源培养c．hutchinsonii全膜及全膜吸附相关蛋白对于相关吸附蛋白的寻找具有重要作用。为了寻找以纤维素及葡萄糖为碳源培养Chutchinsonii之间表达差异膜蛋白，采用双向电泳技术对纤维素、葡萄糖培养获得的总膜蛋白及吸附膜蛋白进行双向电泳检测差异

6、蛋白点。纤维素、葡萄糖培养的总膜蛋白中，有14个差异点；吸附膜蛋白中，发现存在14个差异蛋白点，后续试验需要质谱鉴定这些差异蛋白，并对这些差异蛋白进行性质研究，以揭示可能的吸附机制。5)不同碳源培养条件下膜相关蛋白的同位素相对标记与绝对定量技术(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)定量分析将以纤维素和葡萄糖为唯一碳源分别培养的Chutchinsonii提取总膜蛋白，或以结晶纤维素吸附后所得蛋白进行iTRAQ检测差异分析。在葡萄糖及纤

7、维素上培养的总膜蛋白中，共有182个差异表达的蛋白，其中有90个纤维素上培养的膜蛋自发生上调表达，多数这些差异膜蛋白在分子功能上是与吸附及催化相关的；在葡萄糖上培养的总膜蛋白及吸附蛋白，有89个蛋白在吸附蛋白中的量多于总膜蛋白中的，这89个蛋白可能是吸附之后浓缩了的蛋白，可能参与到纤维素的吸附；纤维素上培养的总膜蛋白及吸附蛋白，有84个蛋白在吸附蛋白中的量多于总膜蛋白中的，这84个蛋白可能是吸附之后浓缩了蛋白，可能参与到纤维素的吸附。以纤维素及葡萄糖为唯一碳源培养提取总膜蛋白经纤维素吸附同时浓缩的蛋白

8、有40个，且浓缩都较为明显。另外，通过超速离心方法提取Chutchinsonii膜相关蛋白，经iTRAQ检测发现有17个可能是纤维素降解或吸附膜相关蛋白，其中9个与GaryXie等对纤维素酶的预测相一致。除此之外，我们检测到8种GaryXie等没有预测到的膜蛋白可能参与纤维素降解或吸附相关膜蛋白，根据功能可以将这17个可能参与纤维素降解或吸附的膜蛋白分成三类即有2个膜相关蛋白仅参与纤维素的吸附，7个膜相关蛋白仅参与纤维素的降解，8个膜相关蛋白既参与纤维素