透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中建立与微生物合成透明质酸分子量调控机制初步地研究论文

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1、山东大学博士学位论文透明质酸合成途径在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明质酸分子量调控机制的初步研究摘要透明质酸(hyaluronicacid，HA)作为一种高分子量的黏多糖，广泛存在于脊椎动物细胞中，发挥着结构、信号传导和信号识别的功能。HA由于其优异的黏弹性、保湿性和支撑作用，被广泛的应用于医药、化妆品、药物传递系统、疫苗和功能健康食品。目前，工业上主要经由革兰氏阳性C型链球菌如兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)发酵生产。但作为生产菌株，链球菌生长速度慢、培养基成本高等劣势日益显现出来，而寻找新的优秀野生生产菌株的希望渺茫。所以，利用基因工程构建

2、合成HA的工程菌株不但有利于克服链球菌作为发酵生产HA菌株的劣势，而且对提高HA的品质，扩大HA的应用范围具有理论意义和应用价值。乳酸乳球菌(Lactoccuslactis)作为革兰氏阳性菌的模式生物，已被广泛应用于食品发酵生产中，且被认定为GRAS(generallyregardedassafe)微生物。乳酸乳球菌由于其自身的优良特性，正越来越多地被应用于代谢工程改造过的现代工业中。在过去的25年中，乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟，其中一系列的诱导表达启动子得到了深入的研究，并已开始应用于工业生产。通过改变小肽、单糖的浓度或诱导温度等调控因子，这些启动子能够实现乳酸乳球菌工程菌

3、株中目的蛋白的可控表达。NICE(thenisincontrolledgeneexpression)系统是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系统之一，已被广泛地应用于该菌株的代谢工程改造。不但诱导剂乳酸链球菌素(nisin)是一种理想的高效安全无毒的食品级诱导分子，而且在NICE系统中可以将染色体上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有lacF基因的质粒结合使用，用食品级筛选标记lacF替代抗生素抗性基因，构建食品级表达系统，而且该方式构建的工程菌株遗传稳定(deRuyter，Kuipers&deVos，1996b；Mierau&Kleerebezem，2005a；Zha

4、ng，Chen，Jia，Chen&Huan，2002)。为了改善现有HA生产菌株的不足，我们计划利用该系统构建既具有合成HA能力的，同时符合公认安全标准的乳酸乳球菌工程菌株。另外，来源于乳糖操纵子PlacR的启动子也是乳酸乳球菌常用的强诱导表达启动子之一。LacR的启动子和NICE系统中nisA启动子已有利用各自诱导剂浓度的变山东大学博士学位论文化在乳酸乳球菌工程菌株中成功实现内源或外源蛋白可控表达的先例。这些特点有助于在本论文中实现乳酸乳球菌工程菌株中szHasA和szHasB基因的可控表达，从而在不同诱导条件下改变兽疫链球菌HAS与UDP．葡萄糖脱氢酶之间表达水平比率，为微生物

5、合成HA分子量调控机制的研究提供了可能。HA在细胞内的合成是一个复杂的过程，有多种酶共同参与。在兽疫链球菌的HA合成途径中，包括透明质酸合酶(szHasA)、UDP．葡萄糖焦磷酸化酶(szHasC)、UDP一葡萄糖脱氢酶(szHasB)、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(szHasD)。其中透明质酸合酶(HAsynthase，HAS)是HA合成途径中的关键酶，具有利用UDP一葡萄糖醛酸(UDP．GlcUA)和UDP-N-乙酰．D．氨基葡糖(UDP．GIcNAc)合成HA的催化活性。UDP一葡萄糖脱氢酶(szl-IasB)、UDP

6、一葡萄糖焦磷酸化酶(szHasC)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(szHasD)是参与HA底物合成的酶类，通过一系列催化反应，分别将葡萄糖转化为UDP．GIcUA和UDP—GlcNAc(Blank,Hugenholtz&Nielsen，2008)。在乳酸乳球菌中，也存在着与szHasB和szHasD相同催化活性的UDP．葡萄糖脱氢酶(UDP．GlcDH)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(LACR)，分别由乳酸乳球菌UDP．葡萄糖脱氢酶基因(ugd)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶基因(以CR)编码。本论文分别将基因szHasA、szHasB和szHasC的ORF重组于

7、NICE表达载体pNZ8148的砌蒯启动子调控之下，得到含有pSH71来源复制起始位点的表达载体pNZ8148．szHasA、pNZ8148．szHasB和pNZ8148．szHasC。将含有质粒pNZ8148-szHasA、pNZ8148一szHasB、pNZ8148一szHasC和pNZ8148-szHasABC的乳酸乳球菌工程菌株分别命名为N9000．A、N9000．B和N9000．C。通过重组表达载体pNZ8148一szHasABC和pNZ8149．szHas