中华绒螯蟹sox21b基因与dmrt2基因的克隆与组织表达分析

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1、上海海洋大学碳±学位论文中华绒螫蟹so×2艳基因及澌r耄2基因的克隆及组织表达分析摘要盘于大部分虾蟹类魏染色体数箧多盥量点状，应篇缁胞遗传学方法研究虾蟹类性剃决定嚣常困难，至今楣关的性别决定视制尚不清楚。本文根据人的攀丸决定基因(SRY_)粒D嫩娃基鼹的保守区设计简著雩}物，结合淞C嚣技术获得Sox2lb基藏魏全长蓐捌帮◇溉重2保守嚣片段，缀缓表达检测结聚衰弱SoX2l惫耧p黝蛇只程性腺中表达，暗示它们可熊在性腺发育与性别分化中起着重要作用，这两个在憋艨中祷异裴达萋逡蕊竟蹩麓今惹从分子水平上研究中牮绒螫繁瓣注剩分纯过程提供重要分子标记。1．S馘2lb基因竟隆与缀织表达分褥参照入S

2、斛基因酣MJG_boX保守送的序列设计一对简并引物，以雌、雄中华绒螫蟹基函缀渊A为摸板进行篱并雩

3、物PCR扩增，缝票蠛、雄个体均扩增激一条约20鳓p的鼹酌片段，初步说鹳雌雄中华绒螫蟹基嚣组孛均存在S黔盒区榻关基因(Sox基因)。测序恁，共褥到两种不网序列：序列ESl和序列聪S2，其片段长度均为．22酾p，可编码∞个氨基簸。檄据ESl和ES2侉剐分别设计两对特异雩

4、物，并戳管家基隧如蠛a-act撖作阳性对照，研究嚣Sl襄嚣S2基霆在中华绒螯缀鞲巢、虢瘸、，§魅、器腱、鳃、麓神经团等组织以及不同发育时期的卵巢中的表达情况。结果显示，ESl在检测的所有组织中均有袭达，焉嚣2剐只在性繇及

5、排燃麓成熟嬲中有表达，在其它组织中均秃表达。这～检测缝聚谈暌醛2可麓与矬嬲分化戴早潮艇骀发育有关。数性腺特异表达的嚣S2基嚣炎基礁，设计萼

6、物进行S’RAe嚣耥3’姒C登扩增。耨瓣褥的序捌拼接焉得到长为957bp的序列，其中包括3’薯i编码区108bp(不包括polyA)和835却的阅读捱，可编鹬278个氮萋酸。经序列院对及构建系统树蜃将箕定毫兔嚣寒S馘2l套。其蛋基誉到中包括爵鸯S睬基戳靛保守侉烈}跫暖G盒区，还包括位子HMG盒区C端的转录调节区多聚丙氨酸区。果蝇及意大利蜜蜂的So娥{b基圆主要在其艇鼹及郛予孛有袭达，说隳它参与胚翰韵发育过程，本文中没有检测酞sox2lb基因在

7、中鬻绒螫蟹胚胎中懿淡达蕊况，健是在蒸摊毒熬成熟露上海海洋大学硕士学位论文中检测到骶S溅2lb有较强的表达，说爨它有可能作力虞源烈A参与中华绒螫蟹早期的胚胎发育过程。根据所得的cDNA序列在非编码区设计引物对基因组DNA进行扩增，溯序结采表羁蕊SoX2lb基因没有内含子。另外，精巢中的EsSox21b序列与排出的成熟拜中懿转录本辐院，考鼹个碱基键点的突变秘三个碱基滟缺失，这种现象分别是由RNA编辑中的碱基替抉和核簿酸删除编辑造成的。因此，依据精巢中EssoX21b转录本所推导出的氮基酸序列与成熟卵子中的序列相比有两个氨基酸残基瓣差异，说骥基sS能2lb蛋囱在两释链腺中发挥话用时需要

8、不褥型的蛋稻体。。2．D姗2基因保守区的克隆与组织表达参照多个物种的D觚基因DM傈守区序列设计简并弓l物对雌雄中华绒螫蟹的基因缀DNA进行扩增，结果雌雄均扩增爨一条约爻i5鼹静静条繁。测序磊，最终得到～条138bp的Dmrt基因片段，可编码46个氨基酸序列。经NCBI中blast搜索后发现它与人类的D删2最为接近，氨基酸同源性为9l％，所以将此Dmrt序列命名为E国黝瞧。与其它物种静D斌2基函保守区的序剜沈较发现，它与罗氐沼虾的D秘憋熬氨基酸序列完全棚圈，与脊椎动物黪D嫩跑基因相眈，有三个氨基酸的差异，但是锌指结构所必需的氨基酸馒点是完全保守的。这说蹦D斌基因在进化上非常保守，在

9、进化等级越近的物种间保守性越高。根据毫测得鹣。鼗淑2基因保守区序列设计一对特异弓

10、物，并以{，et酗actin俸阳性对照，检测它在中华绒螫蟹健腺、既凌、心脏、群脏、鳃、腿神经团以及捧趱的卵等组织中的表达情况。结果表明，EsD姗舵只在排出的卵中肖表达在其它组织中无表达。这一表达现象说明它可能作为母体内源RNA参与胚胎早期的发育过程。关键词中华绒螫蟹，Sox基因，D烈基嚣，RACE扩增，缀织检测，上海海洋大学硕士学位论文一_一_—————————————————————————————————————————————————————————一CloningandExpressio珏o

11、fSox2lbgeneandDmrt2ge魏einChineseMittenCrab腑幽e加s觑e刀s鼢ABSTRACTMostofs聪mp繇de嘲盎e醅omoso攥esafe逦p强e{i南凇，thefefo愆i{is重蕊e毽l￡幻studytheirsexdeterminationandgonadsdifjf’erentiationbyc”ogeneticmethod，sotheirmechanismofsexdeterlninatiOnandgonadsdia宅rentiat