灵芝孢子粉抗肿瘤作用及其质量控制的初步研究

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1、硕士学位论文灵芝孢子粉抗肿瘤作用及其质量控制的初步研究硕士研究生：王筱婧指导教师：徐江平摘要目的：研究灵芝孢子粉在体外对HepG2细胞生长的抑制作用，建立裸鼠移植瘤模型研究灵芝孢子粉在体内对肝肿瘤的抑制作用并初步探讨其作用机制：对灵芝孢子粉的两个有效成分灵芝三萜及灵芝多糖进行含量测定，为进一步开发和应用灵芝孢子粉提供依据。方法：(1)运用MTT法研究两种灵芝孢子粉在2500p,g／ml、1250I_tg／ml、6251xg／ml、312．5¨g，ml四个不同浓度下，对HepG2细胞的抑制作用；通过

2、流式细胞术研究两种灵芝孢子粉在3mg／ml、6mg／ml两个不同浓度下对HepG2细胞生长周期的作用。(2)建立裸鼠皮下移植瘤模型，采用随机区组设计法随机分为空白组、阳性组及灵芝孢子粉高、中、低剂量组。空白组腹腔注射生理盐水，阳性组腹腔注射5一氟脲嘧啶，灵芝孢子粉分高、中、低剂量组(分别为2．Ig／kg、1．059／kg、0．59／kg)灌胃给药，观察裸鼠肿瘤生长情况，给药21天后处死，取瘤组织称重，计算抑瘤率。取高剂量组及空白组做病理观察，采用苏木精一伊gI：(HE)染色法观察肿瘤组织结构和细胞

3、形态改变。(3)通过免疫组化(SP法)及病理lmagepmPlus5．0彩色图像半定量分析系统检测裸鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达。(4)以灵芝酸C2为标准品，通过高效液相色谱法I中文摘要对灵芝孢子粉中灵芝酸C2的含量进行测定。色谱条件为：检测波长254nm；流动相为甲醇：水=55：45。各加1％冰醋酸；柱温40"C；流速O．7ml／min。并通过紫外分光光度法对灵芝孢子粉中三萜类成分的含量进行测定，含量以灵芝酸C：计。(5)以葡萄糖为标准品，采用硫酸一葸酮比

4、色法，通过紫外一可见分光光度法对灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量进行测定。结果：(1)MTT实验结果表明，两种灵芝孢子粉对HepG2细胞的生长均有明显抑制作用，并且抑制率随时间及剂量的增加而升高。浓度为2500pg／ml时，作用时间为48h、72h、96h后，两种灵芝孢子粉对HepG2细胞生长的抑制率分别是29．6％，51．4‰47．2％和30．2％，50．8％，48．4％。两种灵芝孢子粉对HepG2细胞的IC50值随作用时间增加而减小，72h达到最低，分别为1．93mg／ml和2．14mg／ml。流式

5、细胞术结果表明，灵芝孢子粉3mg／ml时，对HepG2细胞生长的抑制作用主要在G2期，两个灵芝孢子粉组HepG2细胞G2％为1．9％和4．6％，而溶剂对照组HepG2细／抱G2％为8．0％：灵芝孢子粉6mg／ml时，硼．,HepG2细胞出现凋亡峰。(2)裸鼠移植瘤实验表明，灵芝孢子粉给药剂量为2．19／kg(高剂量组)、1．059／kg(中剂量组)和O．59／kg(低剂量组)时，对裸鼠移植瘤的抑制率分别为58．7％、39．4％和19．5％，其中高剂量组、中剂量组与空白组比较均有显著差异(尸<0．们

6、)。肿瘤组织切片，HE染色后镜下观察，灵芝孢子粉高剂量组与空白组相比，肿瘤坏死区域较大，细胞异型性较小。(3)免疫组化实验结果经ImageproPlus5．0病理图像半定量分析系统处理。其中空白组VEGF表达的灰度值和阳性面积比分别为179和0．305，MVD表达的阳性面积比为0．096。灵芝孢子粉高剂量组VEGF表达的灰度值和阳性面积百分比分别为164和O．210，MVD表达的阳性面积比为O．043，灵芝孢子粉组VEGF、MVD的表达水平较空白组有明显下降。(4)HPLC法测得三批灵芝孢子粉中灵

7、芝酸C2含量约为O．129960，O．108960和O．094％0，II硕士学位论叉回归方程Y=17．0919X．22．938，r=0．9999，灵芝酸C2在7．35p．g／ml～147,u．g／ml范围内，浓度与峰面积呈线性关系，回收率为95．9％，95．6％和96．4％。紫外分光光度法测得三批灵芝孢子粉中三萜类成分含量为1．321％o，1．131％o和0．910％o，回归方程Y=0．0152X一0．0279，r=0．9997，灵芝酸c2在5．6～112／ag／ml范围内，浓度与吸光度程良好的线

8、性关系，回收率为95．8％，95．4％和95．2％。(5)紫外一可见分光光度法测得三批灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量约为1．152％，1．129％和1．007％，回归方程为Y=0．0091X，r=0．9991，葡萄糖在14．9,ag／ml～119．199／ml的范围内，浓度和吸光度呈线性关系，回收率为95．O％，95．1％和95．2％。结论：(1)MTT实验结果表明，高剂量的灵芝孢子粉对HepG2细胞具有直接的抑制作用，并呈剂量和时间依赖性。流式细胞术结果表明，灵芝孢子粉可作用于Hep