拟南芥f-box基因atpp2-b11功能分析及苹果ring+finger型泛素连接酶e3家族分析

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1、山东农业大学博士学位论文中文摘要泛素/26S蛋白酶体途径是一类重要的翻译后修饰过程，它能有效地调节功能蛋白质的选择性降解,是生命过程进行精确时空调控的重要环节之一。其中，泛素连接酶E3是在底物的特异性选择降解过程中作用最为关键成员。拟南芥基因组中大约5%的基因（大约1400多个基因）编码泛素连接酶。在众多的泛素连接酶类型中，F-box型和RINGfinger型是家族成员最多的两大类。本文通过对F-box和RINGfinger型基因的功能和结构的分析，揭示了泛素连接酶E3在基因表达调控中的重要作用。结果如下：（1）本文首先分析了一个拟南芥F-box类型蛋白的功能。利用生物信息

2、学的方法，在拟南芥1488个泛素连接酶E3中分离到了31个含有DRE元件的E3，通过RT-PCR的方法确定了它们在干旱处理下的表达量变化情况，并从中挑出了一个受干旱诱导较明显的F-box基因AtPP2-B11进行了进一步的研究。（2）qRT-PCR的实验证明，AtPP2-B11受到干旱的诱导。GUS活性实验表明，AtPP2-B11基因上游启动子区域的DRE元件对于干旱响应起到了一定作用。同时，实验证明AtPP2-B11基因还受到ABA的部分诱导，表明AtPP2-B11基因可能是通过依赖ABA和不依赖ABA两种途径参与对干旱的响应。（3）将AtPP2-B11基因转入野生型拟南

3、芥中进行干旱处理实验，发现超表达AtPP2-B11基因明显的减弱了植株的干旱抗性。qRT-PCR检测LEA14，COR15a，RD29A等下游干旱响应基因时发现，在干旱处理时下游基因的RNA水平均降低，干旱处理后下游基因发生了不同程度的下调，表明AtPP2-B11基因可能通过影响这些下游基因从而改变了植株的抗旱性。（4）通过酵母双杂交系统，我们以AtPP2-B11蛋白为诱饵，筛选了拟南芥干旱诱导的cDNA文库，共得到约20个阳性克隆，测序后发现可以与AtPP2-B11蛋白发生相互作用的蛋白包括LEA14，HSP70等蛋白。利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步分析发现，A

4、tPP2-B11蛋白可以与LEA14蛋白发生相互作用，暗示了AtPP2-B11基因很可能作为一个负调因子，通过调节LEA14基因的活性来影响植株的干旱抗性。（5）另外，我们还利用生物信息学的方法对苹果中的RINGfinger型蛋白进行了数量和结构的预测及鉴定。我们发现在苹果的基因组中有688个RINGfinger结构域分布于634个RING型蛋白中。根据其结构特征我们将苹果中的688个RINGfinger结构域分为9大类：367个RING-H2，208个RING-HC，10个RING-C2，35个RING-v，1个1F-box蛋白的功能分析和RINGfinger蛋白的家族分

5、析RING-D，11个RING-S/T，2个RING-G，10个RING-mH2和44个RING-mHC。其中，前7类是在拟南芥中曾经出现过的，后2类是在苹果中首次发现的。结构分析描述了每一种RING型结构域的典型特征。同时还鉴定了RING型蛋白中除了RING结构域以外的其他结构域，为将来RINGfinger蛋白的功能研究奠定基础。关键词：F-box；DRE元件；AtPP2-B11；干旱；生物信息学；RINGfinger；苹果2山东农业大学博士学位论文FunctionalcharacterizationofF-box-containinggeneAtPP2-B11andge

6、nome-wideanalysisoftheRINGfingerproteinsinappleAbstractTheubiquitin(Ub)/26Spathwayisamajorsystemforproteindegradationthatisconservedinalleukaryotescells.ThespecificityofubiquitinationislargelydeterminedbythemanyisoformsofE3thatrecruitsspecifictargetprotein(s).InArabidopsisthalianamorethan140

7、0genes(~5%oftheproteome)encodesubunitsoftheE3ubiquitinligases,whichconfersubstratespecificitytothepathway.F-boxandRINGfingergenesarethemostcommonfamilygenesinArabidopsis.ThefuctionandstructureanalysisofF-boxinArabidopsisandRINGfingerproteinsinappleprovidevaluab