双肿瘤靶向基因病毒治疗载体的构建与介导抑癌基因hccs1治疗肝癌的实验的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体的构建及介导抑癌基因HCCS1治疗肝癌的实验研究摘要目的构建一个双“肿瘤靶向”的基因-病毒治疗载体，并插入新肝癌抑制基因HCCS1（hepatocellularcarcinomasupressorgene-1，肝癌抑制基因-1）的表达盒来验证其治疗的靶向性和有效性，同时进一步揭示HCCS1在肝癌治疗中的重要作用。方法通过重叠延伸PCR缺失pZD55载体上的E1A启动子区域，并引入多克隆位点，获得pMD55。抽提大鼠基因组DNA，PCR获取含PEG-3（progressionelevatedgene-

2、3，促肿瘤进展基因-3）启动子核心元件的最小有效片段，简称PEG-3p。构建pGL3-PEG-3p，并以荧光素酶试验测定PEG-3p启动子在肝癌细胞中的相对转录活性。将PEG-3p亚克隆入pMD55，获得双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体pPD55。用BglII将pZD55-HCCS1上的HCCS1表达盒切下，亚克隆入pPD55载体中，获得pPD55-HCCS1后，与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，通过在细胞内同源重组，包装出PD55-HCCS1病毒，病毒经过3次空斑纯化，通过PCR鉴定病毒的TM正确性。构建pShuttle-PEG-3p

3、-HCCS1，并通过Adeasy系统包装1上海交通大学硕士学位论文Ad-PEG-3p-HCCS1病毒，通过PCR鉴定病毒的正确性。Westernblot检测PD55-HCCS1与5个对照病毒在正常和恶性肝细胞中介导E1A和HCCS1蛋白表达的情况。结晶紫染色观察各腺病毒的致细胞病变效应，MTT试验检测各腺病毒感染后的细胞存活率。大量扩增PD55-HCCS1，CsCl梯度离心纯化后用空斑形成实验测病毒滴度。利用原代培养的BEL-7404细胞成瘤，并通过分组瘤内注射PD55-HCCS1和ZD55-HCCS1，比较瘤体的生长曲线和最终的抑瘤率。免疫组化染色

4、观察HCCS1蛋白在病毒处理瘤体中的表达情况。结果重叠延伸PCR缺失了pZD55载体上210bp的E1A启动子区域，引入了MluI/NotI/BclI三个酶切位点。PEG-3p经PCR成功获得，荧光素酶试验提示：相对于正常肝细胞L-02而言，其在BEL-7404、BEL-7405、QGY-7703、HepG2中的相对活性分别为3.9、4.7、1.5、2.1倍。PEG-3p成功亚克隆入pMD55的E1A启动子区域，并经酶切鉴定，获得pPD55载体。HCCS1表达盒插入该载体中，并成功包装出双肿瘤靶向的基因病毒PD55-HCCS1，纯化后经PCR鉴定正确

5、。成功构建pShuttle-PEG-3p-HCCS1，并TM通过Adeasy系统得到了非增殖型腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1，PCR鉴定正确后，连同Ad.Null、ONYX-015、Ad-CMV-HCCS1、ZD55-HCCS1共5个病毒作为PD55-HCCS1的对照。Westernblot显示PD55-HCCS1能够介导E1A及HCCS1在肝癌细胞中的特异性表达。结晶紫染色和MTT试验均显示，PD55-HCCS1在没有增加正常细胞毒性的情况下，保持甚至提高了2上海交通大学硕士学位论文10肿瘤细胞的抑制率。大量扩增得到的PD55-HCCS1滴度

6、为5×10pfu/ml。动物实验显示，PD55-HCCS1注射组较ZD55-HCCS1组生长速率慢，且在接种后第35天时，抑瘤率达到（77.41±11.65）%。免疫组化显示PD55-HCCS1能够介导肝癌细胞内HCCS1蛋白的大量表达。结论本研究成功构建了一个双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体，能够最有效地介导病毒在肿瘤细胞内的增殖及治疗基因的大量表达。同时实验进一步提示，HCCS1在诱导细胞凋亡及肝癌治疗中的重要作用，为肿瘤的基因-病毒治疗提供了新内容。关键词双肿瘤特异性增殖腺病毒，HCCS1，靶向肿瘤基因－病毒治疗，肝细胞肝癌3上海交通大学硕士学位论

7、文CONSTRUCTIONOFDUALCANCER-SPECIFICGENE-VIROTHERAPEUTICVECTORANDPOTENTANTI-HEPATOMAEFFECTOFHCCS1VIATHISSYSTEMABSTRACTObjectiveToconstructadualcancer-specificgene-virotherapeuticvector,andtoverifyitstumor-targetingcharacterandtherapeuticefficacyviainsertingtheexpressioncassetteof

8、novelhepatomasuppressorgeneHCCS1(hepatocellularcarcino