tdi在大鼠体内的代谢与其剂量效应关系的研究

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1、l主要试剂和仪器2，4-TDI(质量分数为9596)；2，4一甲苯二胺(2，41DA)，sigma公司；甲苯，色谱纯；七氟丁酸酐，98％；氢氧化钠溶液，4509／L；盐酸溶液；1mol／L；硫酸，3aol／L：缓冲溶液：称取27．29磷酸二氢钾，用200ral水溶解．用氢氧化钠溶液调节pH至7．0；碱性饱和苦味酸溶液；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、Y一谷氨酰基转移酶杖m、肌酐(cr)、总胆红素(，IBIL)、尿素氮㈣)检测试剂盒(南京建成生物制品公司)。HOPE掘D8050A型动式染毒柜(天津合普公司)；冲击式采样器；岛津Gc一2

2、010气相色谱仪，配置EcD检测器，RESTEKRtx一50，30m×0．25mm×0．25Pm毛细管色谱柱；梅特勒XP一206分析天平；漩涡混匀器：恒温水箱：离心机。2方法2．1染毒模型的建立TDI蒸气的发生与检测：TDI通过雾化器混合空气逸入HOPE地D8050A型动式染毒柜中，后经管道收集、排放。染毒柜内保持一定的负压，避免毒物外泄。气相色谱法(GBZl60．67-2004)测定空气中TDI浓度，每lh采样1次，每次2个平行样，采样时间为15min，，通过适当校正混合气流量以及纯净气流量以达到所需的染毒浓度。选用成年SD大鼠48只，雌雄各半，体重180"--2

3、209，按体重随机分成4组，每组12只，采用以上TDI蒸汽发生装置对大鼠进行呼吸道染毒，据相关研究2，4一TDI经呼吸道染毒，大鼠的半数致死浓度LC∞为98mg／m3，随机为4组：49．88_+3．96mg／m3(1／2LC∞)、12．44±1．30mg／m3(1／8LC50)、3．26±0．63mg／m3(1／32LC∞)以及空白对照组(正常饲养)，连续染毒5d，每天4h，染毒期间禁止摄食及饮水。每天染毒后放入代谢笼饲养，期间正常饲养，用代谢瓶收集此后20小时的尿液，然后转移至25mL的聚乙烯塑料瓶中，标注清楚后，一部分立即送往实验室测定肌酐，另一部分-20℃冷藏

4、保存，待测。末次染毒后，禁食禁水，于次日处死大鼠，眼眶取血，2000r／min离心lO分钟，分取上层血清，置于全自动生化分析仪进行测定判定ALT(U／L)、&ST(U几)、GGT(U／L)、ALP(u／L)、TBIL(umol／L)、BuN(mol／L)、Cr(11mol／L)等肝肾功能相关生化酶水平。2．2鼠尿中1DA的测定方法．2．2．1气相色谱条件仪器条件：根据TDA的气相色谱的出峰情况确定进样口、柱温、检测器温度分别为290℃、160℃、320"C，柱流量为1．OOml／min，分流比为20：1，在此条件下能够将TDA峰和七氟丁酸酐衍生物及尿样中的杂峰分离开

5、，见表l。表1气相色谱条件项目条件色谱仪岛津GC一2010检测器电子捕获检测器(ECD)色谱柱RESTEKRtx-50，30mXO．25mm×O．25Pm毛细管色谱柱汽化室温度℃290．柱温℃160检测器温度℃320柱流量ml／ain1．00分流比20：1载气N22．2．2鼠尿酸化后水浴时间的选择：同一份含有TDA的尿样，分成6组，每组6份，1份未酸化，其余5份分别水浴酸化处理Oh、2h、4h、8h及16h，对不同组的测定结果进行统计学分析，选择最优的酸化时间。2．2．3鼠尿中TDA的测定吸取2．Oml尿样于lOml离心管中，加1．5ml硫酸溶液，摇匀，盖好，放置于

6、沸水浴加热8小时，取出冷却至室温，加5ml氢氧化钠溶液混匀，加2ml甲苯，振摇2min，于1500r／min离心10分钟。取出约1．5ml甲苯层，放入另一离心管中，加20uL七氟丁酸酐，振摇2min，放置10rain，加iml缓冲液，振摇2min，以除去过剩的七氟丁酸酐，放置2min，将甲苯层转移入另一离心管中，在表1色谱条件下气相色谱法测定，保留时间定性，峰面积定量。2．3统计学分析应用SPSS18．0进行相关统计学分析，多组间比较TDA含量，采用方差齐性检验和单因素方差分析(OneWayANOVA)。进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验(Stud

7、ent-Newman-Keuls法)；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。二结果l染毒柜中TDI蒸汽浓度的检测结果通过控制动式染毒柜中混合气流量和纯净气流量，进而来调节染毒柜中TDI蒸汽的浓度，采用气相色谱法(GBZl60．67-2004)测定染毒柜中TDI浓度，每lh采样1次，每次2个平行样，检测结果见表2，对不同染毒天数的对应的各剂量组进行组内统计学分析，结果p>O．05，说明不同染毒天数的各剂量组组内浓度无显著差异，这进一步表明明各剂量组染毒浓度比较稳定，染毒柜中TI)I蒸汽的浓度调节控制较好，达到了实验要求。表2染毒柜中TDI蒸汽浓度的检测结