鼠抗人41bbl单克隆抗体制备与其生物学功能的研究

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1、鼠抗人4-IBBL单克隆抗体制各及其生物学功能的研究中文摘要4．1BBL(CDl37L)是H型跨膜糖蛋白分子，与其受体4．1BB同为共刺激分子TNF／TNFR超家族中的重要成员。4．1BBL分子表达在各种活化的免疫细胞表面，如：B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、活化的T细胞等免疫细胞，但在未活化的T细胞上不表达。另有研究显示，在某些肿瘤细胞表面也有4．1BBL分子的表达。4．1BBL的表达与恶性血液病有关：如恶性血液病患者的血清中可溶性4．1BBL(s4．1BBL)含量异常升高；另外，在某些T和B肿瘤细胞系，虽然4．1BBL／4．1BB呈较低的构成性共表达，但4．1BBL／4．1BB信号均可促进

2、白血病细胞增殖并参与白血病细胞耐受抗肿瘤药物的机制。4．1BBL分子与其受体4．1BB结合后可介导双向信号。研究表明，两者相互作用产生的正向信号可促进活化的T细胞增殖，这一过程并不依赖CD28信号；而通过膜4．1BBL传递的逆向信号可以抑制活化T细胞增殖并诱导其凋亡；4．1BBL逆向信号还能诱导单核细胞活化，促进其IL．6、IL．8和TNF．a的分泌以及M．CSF的产生，并延长其生存；逆向信号还能刺激CD34+造血干细胞来源的DC成熟等，如4．1BBL逆向信号可以上调DC细胞上CD86、CD83的表达以及IL．12的分泌。因此，4．1BBL／4．1BB介导双向信号在T淋巴细胞、单核细胞及树突

3、状细胞(DC)介导的免疫调节中发挥重要的作用。但这种4．1BB／4．1BBL双向信号在免疫应答和免疫调节中的作用和确切机理尚待深入研究和全面理解。为此，制各特异性抗人4．1BBL分子单克隆抗体，具备重要的研发价值。本实验制备了一株鼠抗人4．1BBL单克隆抗体39A8，能够识别多种肿瘤细胞株，同时以表达4．1BBL分子的人单核白血病细胞株U937、THP．1及胶质瘤细胞株675321为研究对象，初步研究了单克隆抗体39A8对肿瘤细胞体外生长的影响。本论文共分为两个部分。1．鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株的制备以基因转染细胞L929／4．1BBL作为免疫原，免疫BALB／cd、鼠，采用B淋

4、巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏和小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合，用HAT选择培养基培养。以L929／4．1BBL为阳性筛选细胞株，以L929细胞为阴性对照，通过中文摘要鼠抗人4-IBBL单克隆抗体制各及其生物学功能的研究间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞株进行筛选。用有限稀释法进行阳性杂交瘤的亚克隆化培养。经过多次亚克隆及反复筛选，最终得到一株持续分泌抗人4．1BBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株(39A8)，经快速定性试纸法鉴定，39A8的重链IgG2a，轻链为1c链。杂交瘤细胞株经体外连续传代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。2．鼠抗人4．1BBL单克隆抗体的体外生物学

5、特性研究间接免疫荧光法标记U937、THP．1、Hela、PC．3、Daudi、M231、SHG44等细胞，用流式细胞术分析细胞膜荧光标记百分率和荧光强度。结果显示，4．1BBL能不同程度地在某些肿瘤细胞株上表达。将不同浓度的4．1BBL单抗分别加入到天然表达4．1BBL分子的U937、THP．1、675321细胞的培养体系中，分别在培养24h、48h、72h和96h，观察细胞的生长状态、计数细胞数量并绘制生长曲线。研究结果显示：4．1BBL单抗39A8可促进上述三种细胞的生长与增殖。综上所述，本研究成功制备了一株特异性的鼠抗人4．1BBL单克隆抗体，进而鉴定了其生物学特性；利用抗人4．1B

6、BL单抗初步探讨了4．1BBL逆向信号对肿瘤细胞的生物学效应。因此，这株功能性鼠抗人4．1BBL单克隆抗体的成功制备为其以后的生物学功能和信号途径的研究以及临床诊断试剂盒的研制提供了有效的物质基础。关键词：4．1BBL；双向信号；杂交瘤；单克隆抗体；肿瘤细胞Il作者：柴青指导教师：薛智谋居颂光PreparationandbiologicalcharacterizationofITIOUSCanti·human4-1BBLmon211旦里璺!竺堑!旦!!竺垒!!塑璺坐andbiologicalcharacterizationofmouseanti．human4．1BBLmonoclonalan

7、tibodiesAbstractHuman4—1BBLisatypeIItransmembraneglycoprotein，belongstotu／rlornecrosisfactor(TNF)superfamily．4-1BBLiswidelyexpressedonmanytypesofceils，includingBcells，maerophages，dendriticcells，activatedTce