转基因双歧杆菌治疗小鼠实验性结肠炎的机理分析

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1、暨南大学硕士学位论文转基因双歧杆菌治疗小鼠实验性结肠炎的机理研究明显上升，导致肠道粘膜屏障的破坏，进而细菌和食物粒子过多地进入固有层，最终导致[27]慢性炎症的发生。目前存在两条途径：①、通过白细胞崩解后所释放的穿孔素和颗粒酶A等,致使靶细胞坏死；②、通过Fas/FasL系统，诱导靶细胞凋亡。穿孔素贮存在细胞毒性T细胞和NK细胞胞质颗粒中，是一种细胞毒作用的效应分子。上述细胞与靶细胞接触后发生颗粒胞吐，靶细胞表面在释放出的穿孔素的聚合作用下形成小孔，由此介导杀伤作用。穿孔素发挥细胞毒作用的途径有两条:一是直接与靶细胞膜的磷酰基胆碱结合后聚合成管状结构插入靶

2、细胞膜,导致膜破损,靶细胞溶解坏死；二是介导颗粒酶的分子进入[28][29,30]靶细胞,造成靶细胞凋亡。国内外研究均表明，在UC患者和小鼠实验性结肠炎中，结肠组织的穿孔素表达均明显升高。Fas/FasL系统是指细胞表面的“死亡”受体及其配体分子,Fas/FasL系统的信号传导在诱发细胞凋亡方面起重要作用。机体许多组织细胞具有Fas的表达，抗Fas抗体或FasL通过与Fas结合，进而使表达Fas的细胞凋亡。在UC中，表达FasL的淋巴细胞和单核细胞数增多，它们通过与的结肠上皮细胞的Fas结合，诱导结肠上皮细胞的凋亡，最终破坏粘膜屏障作用，使肠道病原微生物侵

3、入而引起炎症。研究发现[31]，Fas在UC和正常结肠上皮细胞中有表达，FasL在活动性UC炎症部位表达增强，而在正常情况下，表达FasL的细胞很少分布在固有层，提示Fas/FasL介导途径是UC的肠上皮细胞凋亡其中的一个重要机制。Caspase-3是Caspase家族中最重要的一员，在细胞凋亡过程起到重要的作用。多种因素可以活化caspase-3，Fas/FasL途径是其中途径之一。本课题组在前期实验中成功地通过长双歧杆菌（B.Longum，BL）NCC2705构建一种新的、能稳定表达有活性的IL-10因子的传递系统。BL-hIL-10转基因工程菌以双歧

4、杆菌为载体，更好地在肠道定植生长，并且有效地维持肠道微生态的平衡，同时也克服了病毒[33]载体给药不方便的缺点。前期实验通过体内外的研究表明，BL-hIL-10分泌的hIL-10因子具有生活学活性，能明显抑制肠道炎症，对实验性结肠炎小鼠有明显的治疗作用。本实验通过研究经BL-hIL-10治疗后UC模型小鼠的肠道新生血管形成、肠道粘膜屏障和肠上皮细胞凋亡的情况，继续探究BL-hIL-10对UC的治疗机理。3暨南大学硕士学位论文转基因双歧杆菌治疗小鼠实验性结肠炎的机理研究2材料与方法2.1实验仪器与试剂2.1.1实验菌株携带hIL-10的分泌型转基因双歧杆菌(

5、transformingahIL-10-containingplasimidintoB.Longum,BL-hIL-10)，由姚君博士构建及鉴定，证实具有体内外hIL-10蛋白活性。长双歧杆菌(BL，NCC2705)，由南方医科大学细胞微生物学教研室曾位森副教授馈赠。2.1.2实验动物6～8周龄SPF级BALB/c雄性小鼠，体重约23-26g，由南方医科大学实验动物中心提供（合格证号：SCXK粤2011－0015)。2.1.3实验主要试剂1.双歧杆菌普通培养基(BM培养基)：根据广东微生物研究所配方，分别为胰蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，酵母提取物10g，

6、葡萄糖10g，盐溶液40mL(Nacl2g,NaHCO310g,Cacl20.2g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.48g，加入1000mL蒸馏水中，PH为6.5调配成)，0.1%刃天青1mL，加入蒸馏水至1000mL，调PH约为7.0，经121℃，25min高压灭菌，待冷却后，往培养基中加入半胱氨酸(已过滤除菌)，使其终浓度为0.05%，加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL，保存于4℃冰箱。2.酵母提取物，胰蛋白胨，大豆蛋白胨等培养基试剂、细菌蛋白酶抑制剂购、葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量5000)购于广州齐云生物技术公司。3.Evan’s

7、Blue和苏木素染液购于Sigma公司。4.大便潜血检测试剂盒购于广州斯佳生物技术公司5.人白细胞介素10ELISA试剂盒购于北京绿源博德生物科技有限公司，小鼠白细胞介素13、内皮细胞生长因子A、一氧化氮ELISA试剂盒购于广州菲博生物科技有限公司。6.Tunel试剂盒购于MERK公司。7.荧光定量PCR试剂、Oligod（T）Primer试剂、RandomPrimer试剂购于TaKaRa公司。8.甲醇、无水乙醇、丙酮、二甲苯、无菌PBS液等购自广州齐云生物技术公司。2.1.4主要试剂的配制1.4%多聚甲醛溶液取多聚甲醛40g加入PBS液（500ml）中，

8、经搅拌、60℃水浴加热后震荡24h，滴加NaOH溶液后冷却直至室温