nr4a2基因在胃癌侵袭转移中的作用及其机制的研究

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1、NR4A2基因在胃癌侵袭转移中的作用及其机制研究摘要【目的】检测胃癌(GC)中NR4A2基因表达水平，从NR4A2表达调控机制出发筛选新的选择性剪接异构体，进一步检测异构体在胃癌中的表达。探讨NR4A2及其异构体与GC发生和转移的关系。【方法】l、采用实验室前期cDNA基因表达谱：卷片(GEO：GSM253487toGSM253498)分析结果，利用生物信息学方法筛选出胃癌转移相关新基因NR4A2，采用RT-PCR，real-timePCR检测28例手术切除的胃癌原发组织、癌旁正常组织和转移灶组织中NR4A2mRNA

2、的表达，免疫组化检测23例组织样本NR4A2蛋白表达。2．从NR4A2基因调控机制出发，通过选择性剪接数据库(AlternativeSplicingDatabase，ASD)对基因NR4A2可能存在的选择性剪接异构体进行预测，半定量RT-PCR检测胃癌样本中预测异构体的表达情况。PCR产物凝胶回收，T载体连接，经a筛选后转染DH5Q感受态细胞，菌液送测序，应用计算机软件进行测定序列的比对分析。经验证从组织中扩增的产物与生物信息学预测结果一致，确认为新的选择性剪接异构体。3．选择28例配对样本，采用real—timeP

3、CR检测新剪接异构体在胃癌组织样本中的表达。【结果】同癌旁组织比较，NA4A2在20对原发胃癌组织中呈现低表达，P=：0．017：同原发癌组织比较，NA4A2在8对胃癌肝转移样本中呈现低表达，P值为：0．001。采用Envision免疫组化方法检测NR4A2蛋白表达，无统计学意义(X2=1．543，P=O．672)，但阳性率趋势同real-timePCR一致。发现2种新的剪切异构体NR4A2-I和NR4A-II，real—timePCR检测表明同癌旁组织相比较两种异构体在胃癌原发灶中表达下调(P=0．007，0．01

4、8)；同原发癌组织比较两种异构体在转移灶表达下调(P=O．004，0．016)。。+【结论】NR4A2基因的表达水平与GC的转移密切相关。确定NR4A2存在2种剪接异构体，证实其表达水平同胃癌转移相关，其异构体是影响该基因表达水平的主要原因。为确定胃癌新的转移及预后判断肿瘤标记物提供了理论依据，可能成为肿瘤的治疗提供新的途径。【关键词】NR4A2；Nurrl；胃癌；转移；剪接异构体第二军医大学硕士学位论文Abstract[Objective]TodetectexpressionofNR4A2geneingastric

5、carcinoma(GC)．ToidentifysplicevariantsofNR4A2andinvestigatethemRNAexpressionofsplicevariantsingastriccarcinomatissues．Finally，todeterminetherelationshipbetweentheexpressionofNR4A2andsplicevariantsonmetastasisandoncogenesisofGC．[Method]cDNAmicroarray(GEO：GSM2534

6、87toGSM253498)techniquewasusedtodetectthedifferentiallyexpressedgenes．AfterscreeningwithDNAmicroarray,NR4A2geneWasdown-regulatedinmetastasisGC．TheexpressionesofNR4A2mRNAswhichwereextractedfromhumangastriccancertissues(GC)，paracarcinomagastricmucosatissuesandmet

7、astasisof28patientsweredetectedbyRT．—-PCR，real-timePCR．TheproteinexpressionofNR4A2wasdetectedbyimmunohistochemisty(IHC)in23cases．AlternativeSplicingDatabaseWasusedtopredictthesplicevariantsofNR4A2．Usingthespecificprimersets，thesplicevariantswereidentifiedinmeta

8、statictissues，primaryGeandnormaltissuesadjacenttocanoe．ThevariantswereamplifiedbyRT-PCR,andwereclonedintopMD18一Tvector,whichweresubsequentlytransformedintoE．ColiDH5a．Afteraf