副溶血弧菌和创伤弧菌双重real-time+pcr检测方法建立及其的应用

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1、英文摘要副溶血弧菌和创伤弧菌双重Real．timePCR检测方法的建立及其应用摘要副溶血弧菌(HbrioParahaemolytieus)和创伤弧菌(Vibriovulnificus)是引发食源性疾病的重要病原菌。研究数据表明，50％-～70％舀食用海产品引发的疆泻病例是由副溶血弧茵引起的。创伤弧菌通过进食生的牡蛎穿过胃肠道黏膜或通过破损的皮肤接触海水入血而感染，并在短时间内出现败血症和蜂窝组织炎、出血性大疱，一旦出现败血症，其死亡率高迭60％。因此，副溶血孤茵和创伤弧菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中副溶血弧菌和创伤弧菌及数量具有重要的实际意义。荧光定量PCR技术根据荧光能量传递原理，融

2、合了PCR技术的高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点，可直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量结果。根据荧光定量PCR多通道激发光源，多个滤光片的检测体系以及标记不同荧光染料的探针，可达到同时检测两种或更多种细菌的目的，为同步定量检测食品中的副溶血孤菌和创伤弧菌提供了必要的条件。本文建立了用单一Real．timePCR技术定量检测副溶血弧茵和用双重Real-timePCR技术同步定量检测副溶血弧菌和创伤弧菌的新方法，并用该方法及传统的培养方法对华东地区海产品中副溶血弧菌和创伤弧菌的污染情况进行了调查。试验I从单一Real-timePCR技术八手，根据GenBan

3、k公布的副溶血孤茸的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针，建立了基于TaqMan探针的Real—timePCR方法。通过对9种细菌(12抹菌株)的DNA进行扩增，结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线，其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线，证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养液和人工布茵样品的检测敏感度分别为1CFU／PCR反应体系和10CFU／PCR反应体系，相关系数均为0．99(r2=O．99)。整个试验可于lh内完成。该试验建立的方法可快速定量检测海产品种的副溶血弧菌。试验II针对副溶血弧菌的gyrB基因序列和创伤弧菌的wh序列分别设计引物和a'aqgan探针，建立双重

4、Real．timePCR检测体系，制作标准曲线，同步定量检测副溶硕士学位论文：副溶血弧菌和创伤弧菌双重Reat—timePCR榆溟4方法的建立及其应用血弧菌和创伤弧菌。。建立的双重Real-timePCR方法对两种细菌菌液的检测敏感度均为10CFU／PCR反应体系，整个试验可在1h内完成。建立的方法可用于副溶血弧菌和创伤弧菌的快速、同步、定量检测。试验III对华东地区海产品中副溶血弧菌和创伤弧茵的污染情况进行了调查。为了解副溶血弧茵和创伤弧菌在我国沿海地区的分布情况，利用建立的Real．timePCR方法以及传统的培养方法对华东3省市5个地区的生鲜加工厂，超市和市场上的600份海产品进行副溶血

5、弧菌和创伤弧菌检测。结果表明，副溶血弧菌检出率为18．5％，创伤弧茵的检出率为6％。定量PCR结果显示华东地区海产品存在不同程度的副溶血弧菌和创伤弧菌污染，如果加工不当或饮食习·f贯不卫生，会对消费者的健康构成潜在威胁。关键词：副溶血弧菌；创伤弧茵；双重Real．timePCR；海产品；检测II英文摘要THEESTABLISHMENTANDAPPLIFICATIONOFMULTIPLEXREAL一7ⅡMEPCRFORDETECTIoNoFⅥBRIOPARAHAEMOLYTICUSANDⅥBRIoVULNIFICUSABSTRACTVirioparahaemolyticusandVibriovu

6、ln胡CUSaretwoofpathogenicvibriospeciesprimarilyinvolvedincausinggastrointestinalillnesses．矿parahaemolyticusisconsideredt0bethecausativeagentin50％to70％ofallcasesofdiarrheaassociated丽t11theconsumptionoffisheryproductsinthesummermonths．磙briovuln批mproducesarapidlyfatalsepticemia,withamortalityrateofupto6

7、0％，whichisprimarilyassociatedwiththeingestionofrawoysters．ContactofwoundswithseawaterorshellfishcartalsoleadtoseriousinfectionsthmcallprogresstosepticemimTherefore，thedetectionofthepresenceandthenumbe