立枯丝核菌ag1ia诱导玉米差异表达基因的研究

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1、'●j摘要玉米纹枯病是由立枯丝核菌RhizoctoniasolamKOhn引起的真菌性病害。尽管该病主要发生在中国和东南亚地区，表现出一定的区域性，但是该病在近年内表现出逐年加重和快速蔓延的趋势，极有可能在未柬几年传播到其他国家和地区，并成为一种世界性病害，在我国玉米主产区，该病已成为制约玉米产量高低的主要病害，深入研究玉米对纹枯病的抗病机制，是寻找培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种的有效途径。本研究利用电镜检测技术、抑制消减杂交(SSH)cDNA文库构建技术、反向Northern筛选技术、RT-

2、PCR以及生物信息学分析方法相结合，通过建立相关抗病基因表达谱，从全基因表达的水平上探索玉米对纹枯病的系统抗病机制。实验所用材料为本课题组多年筛选鉴定出的高耐玉米纹枯病材料R15，纹枯病菌为立枯丝核菌高致病性融合菌群AGI—IA。玉米种子经表面消毒，发芽，温室培育幼苗至五叶期后移入大阳，拔节期时采用人工嵌入法将两粒靠满菌丝的麦粒接种到植株下位第三叶鞘，接种后接种部位用塑料袋包裹以保温、保温，接种6小时后取下塑料袋，分别取接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的玉米第三下

3、位的叶片和叶鞘，电镜观察菌丝在接种叶鞘组织中的形态变化，提取叶片的总RNA构建SSH差减文库。获得的主要结果如下：1．采用电镜检测病菌的侵染过程后发现，接种12h后，菌丝在叶鞘细胞表面伸长并生成少量分支；接菌后24h，菌丝交错生长，呈现多分支的网状结构；按菌后36h菌丝继续分支、交错、缠结，形成侵染挚雏形：接种后48h形成成熟侵染挚；接种后60h，侵染垫继续增大，形成团状或带状菌丝团；接种后72h、84h、96h，伴随新一轮的菌丝生长、分支、侵染挚形成等在叶鞘组织上扩展，从而完成对寄主的扩大侵染。另

4、外，在接种24h后的各时IBJ段均观测到菌丝通过侵染钉直接进入寄主或菌丝通过气孔侵入寄主，病原菌大面积侵入寄主是在接菌后36,．-48h。而在接种72h以后，在叶鞘组织的横断面内发现侵入的菌丝，说明菌丝侵入寄主后能在受侵细胞问扩展。2．应用数码相机记录病斑扩展过程后发现，接种部位在接种后12h未出现病斑：在接种后24h有水浸状小病斑出现；接种后36h病斑丧失叶绿素而呈白色；接种48h后在形成的白斑周围出现新的水浸状病斑的大面积扩展；接种后60h扩大的病斑丧失叶绿素呈白色，并与之蓟白色病斑连在一起组成

5、两个明显的病斑；接种后72h，水浸状病斑再次出现并逐渐纵下扩展，丽之前形成的两个病斑轮廓更加明显：接种后84h形成3个白色病斑；接种后96h水浸状病斑继续扩展，且与前面三个病斑相连，形成典型的纹枯病发病症状。3．通过SSH和文库构建技术，分别构建了R15受纹枯病病菌诱导后的正向和反向文库。其中正向文库包含480个克隆，反向文库包含288个克隆。文库插入片段的长度介于200--,750bp之间，平均长度在450bp左右。4．通过反向Northern杂交筛选，从正向文库中筛选到正反杂交信号差异显著的阳性

6、克隆54个，从反向文库中筛选到阳性克隆30个。将筛选到的阳性克隆送交测序公司测序，序列经DNAMAN软件去除载体冗余和引物序列后进行序列问同源性比对，共获得51条唯一的EST序列，其中来源于正向文库的EST序列30条，来源于反向文库的EST序列2l条。5．将筛选获得的5l条EST序列提交到Genbank进行Blast比对，共获得已知基因功能的EST序列35条，已知mRNA序列12条，新发现EST序列4条。对已知基因功能进行分类后发现；基因参与抗病或防御途径(23％)、信号传导(20％)、转录调控(1

7、7％)、次级代谢(14％)、蛋白质修饰加工(6％)、初级代谢(6％)、能量代谢(6％)、蛋白质转运(6％)等代谢途径，另外还有1个与细胞结构(3％)有关。6．采用RT-PCR方法对几个重要功能的基因进行不同时间段的表达验证，分析与玉米纹桔病菌诱导抗性相关基因的时空表达情况，结果发现不同功能的基因在不同时间段的诱导表达量各不相同。7．利用生物信息学方法并结合比较基因组学手段，将本试验获得的已知功能的35条EST序列，与水稻基因组进行比对，确定其在水稻染色体上的位置，并得到与其紧密连锁的分子标记，利用比

8、较图谱分析该标记在玉米染色体上的同源标记，获得了其中25条EST序列在玉米染色体上的SSR标记。而令我们感兴趣的是一条代表丝氨酸羧肽酶基因的EST序列经分析后发现，在水稻基因组中与该EST序列临近的SSR标记为RM25574，而该标记与玉米第一染色体上的SSR标记umcl245同源，同时该标记又与课题组利用R15作为抗性亲本构建的群体所定位的玉米纹枯病抗性QTLqBLSBl一c紧密连锁，另有四个差异基因与抗性QTL存在连锁关系．8．对本试验获得的功能基因进行系统研究后