irfanpv和orernpv生物学和分子特性的研究

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1、浙江大学博士学位论文摘要随着近代科学技术的进步，越来越多的昆虫病毒被鉴定出来，昆虫病毒的性质也逐渐被人们了解。本文利用屯镜观察了茶刺蛾核型多角体病毒脚池s启∞勰singjeNucleopolyhedrovirus(I嘞NPV)和灰斑古毒蛾核型多角体病毒D倒抽P，Ic口PsingIeNucleopolyhedrovi九Js(ore小『PV)超微形态。利用建库和PcR方法定位和克隆了两种病毒的多角体蛋白基因(p。Jyhedrln，ph)，分析了Ir洲PV肋。RI，砌DI11．626kb大片段13个oRF以及EcDRI4

2、．2门6kb片段2个oRF部分序列的分子特性，确定了以上两个病毒与其它杆状病毒的亲缘关系；酶切分析了Ore栅v基因组，生物测定了Ore小伊v毒力。同时探讨了IrfiNPv与非宿主的1N．581．4细胞间的侵染关系，检测了IrfaNPv在非宿主的1N．581．4细胞中的复制。对与AcMNPvoRF38、Ac^4卜『PvO船150同源的IfAc38、If-Acl50两个基因进行原核表达与多克隆抗体制备，分析了Ac38与Acl50在n●581—4细胞中的表达时相。主要研究结果包括下列四个部分：1_IrfaNPV形态特征和

3、基因组部分序列分析我们从茶刺蛾Iragoides缸ciata幼虫分离得到核型多角体病毒，病毒粒子的横切面特征显示该病毒为单粒包埋型：以核型多角体病毒ph基因兼并引物，将I恤NPV的ph基因定位在IrfaNPv基因组11．6kb艮DR艘幻I酶切片段上，并测通了该片段，其Gc含量为3173％。同源性分析表明Ir趾岬vph与其它己知序列的58种杆状病毒的ph同源性都很高，与AcMNPv和BmNPV的氨基酸同源性分别为96％和95％。经过序列分析发现该片段还包含13个ORF开放阅读框，在pk_1和If_Acl50之间存在一

4、个同源重复序列(homologousrepeat，hr)。对&oRI4，2／1．6kb片段的两端序列测定表明，两个片段分别含有Ac47同源基因If-Ac47和编码杆状病毒结构蛋白vP80的饼疆。If礁c47多肽与AcMNPv的O喂F47和BmNPv的ORF38有42％的同源性，与RaouMNPv的ORF44有40％的同源性；对lef2、Iefll、odv．e56、oRFl629、pk‘l、ptp和VP80／P87基因的分子进化均显示IrfⅢPV与AcMNPV、RaouNPV和BmNPV的同源性最高，属于groupI

5、家族。结果表明从茶刺蛾分离出的核型多角体病毒是种与AcMNPv有较近亲缘关系的新的NPv病毒。2．If．Ac38、If_Acl50的原核表达，抗体制备及Acl50和Ac38基因表达检测将IrMPV两个基因If-Acl50和IfAc38分别在大肠杆菌表达系统pGEx一4T-2，BL21和pET_28一a，BL2】中的表达进行了研究。两个基因在pGEx4-2／BL21和pET_28-棚L21系统中浙江大学博士学位论文都得到了高效表达。我们利用AcMNPV感染TN一581-4细胞，分析了If-Acl50和If-Ac38的

6、同源基因Acl50和Ac38在昆虫细胞中的表达时相，通过westemblot分析，间接的说明If．Acl50和If-Ac38分别为晚期基因。3．IrfaNPv侵染非宿主TN．581．4细胞的研究用荧光定量PcR检测了Irf州Pv感染非宿主TN．581—4细胞的增殖动态。结果说明IrfaNPv能够感染非宿主的TN．5Bl-4细胞，可形成少量的Ir脚岬vBv型病毒释放到细胞上清中。在相同细胞中产生的Ir蜘NPvDNA拷贝数只有AcMNPvDNA拷贝数的约1／1140，而且不能象AcMNPv一样产生多角体。4．orerN

7、Pv分子特性研究首先电镜观察了灰斑古毒蛾核型多角体病毒切片，病毒粒子的横切面显示该病毒为单粒包埋型；用EeDRI，j函oI，E叠。Rv，脚月dⅡIandAfI五种内切酶消化OreiNPV基因组DNA分析结果，分别得到了22、30、19、23和26个酶切片段，预测其基因组平均长度为134．6kb。通过ph基因兼并引物，将ph基因定位在OrerNPV基因组&oRI2655bp片段上。分析了Ore栅v系统进化，并绘制了OreiNPv口h基因氨基酸序列与其它已知序列的55种杆状病毒多角体蛋白基因氨基酸序列分子进化树，表明O

8、red心V与OpsNPV亲缘关系最近，与BususNPv和EcobsNPv一起同处于一个小的分支上，与BususNPv和EcobsNPV较接近，并属于NPvII大的分支。同时对灰斑古毒蛾l一4龄幼虫进行生物测定，获得了致死中量LD50及其95％的致信区间，oreI-NPv与其它核型多角体病毒相比具有很高的毒力，一至四龄幼虫的LD50为lO．08、77．4、1