两个养殖海区与栉孔扇贝消化盲囊细菌群落多样性的分析

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1、两种不同扇贝养殖模式海区及栉孔扇贝消化盲囊细菌群落结构季节性变化两个养殖海区及栉孔扇贝消化盲囊细菌群落多样性分析摘要细菌是海区生态环境的重要组成部分，本研究为了解单一养殖模式与贝藻混养模式下的扇贝养殖海区细菌群落结构的季节性变化以及不同模式下细菌群落结构的异同，运用PCR．DGGE技术对沙子口和桑沟湾2种不同养殖模式海区的细菌群落结构组成进行了分析。连续7个月(2009年5-11月)和11个月(2009年5月～2010年4月，2月除外)分别定点采集桑沟湾和沙子口养殖海区水深O．5111和3m处的水样，过滤收

2、集粒径在0．22~3pm的微生物，采用CTAB-法提取样品总DNA，扩增细菌16SrDNAV3~V5可变区序列，并通过变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)技术对所得序列进行分离，采用软件QuantityOne和SensiAnsys进行DGGE指纹图谱分析。试验结果如下：1)桑沟湾海区DGGE图谱共得到231条条带，其中处于不同位置的条带数为26条，每个月份条带数在14~23之间，平均数为19．41。同一月份水深0．5m和3m处的细菌群落组成极

3、为相似(730／o---91％)，不同月份间的细菌群落差异较大，其中8月份细菌种类最为丰富。基于各月份DGGE条带数目和亮度进行UPGMA聚类分析，7个月份的样品中，6、7和11月聚为一类，8、9和lO月聚为一类，5月单独聚为一支。对DGGE图谱中的11条主带进行回收、重扩增和测序，结果表明，这11条序列与GenBank中已登录的细菌物种同源性在91％-99％之间，同源性分析结果表明这些序列中，a．变形茵亚门(a-Proteobacteda)、拟杆菌f-j(Baeteroidetes)和放线菌f-j(Aet

4、inobacteria)均占所测序列的27．3％，B．变形菌亚门和7．变形菌亚门各占9．1％。所分析的11条序列中有lO条序列与GenBank中登录的未成功培养细菌的序列相似度高。2)沙子口11个水深0．5m处细菌样品(2月除外)的DGGE图谱共得到198条条带，其中处于不同位置的条带数为36条，每个月份条带数在15-23之间，平均数为18。其中1月份条带数最多，3月份条带数最少。UPGMA分析显示，11个月份的样品中，春季(3～5月)聚为一大类，夏季到冬季(6~1月)聚为另一大类。对20条荧光强度较高的条

5、带进行测序，发现所有序列与数据库中16SrDNA序列两种不同扇贝养殖模式海区及栉孔扇贝消化盲囊细菌群落结构季节性变化的最大相似性在94％--100％之间。获得的20条序列分属于4个门，其中Q．变形菌亚门占所测序列的35％，p．变形菌亚门和丫．变形菌亚门均占10％，拟杆菌门占25％，放线菌门占15％，疣微菌门(Verrucomicrobia)仅占5％。比对结果显示，20条序列中16条属于海洋未培养的细菌克隆。3)为分析栉孔扇贝消化盲囊内细菌群落结构的周年动态变化，本研究于2009年6月,--2010年6月连续

6、12个月每月采集沙子口养殖区扇贝10只，扩增消化盲囊细菌的16SrDNAV3-V5可变区序列，并通过PCR．DGGE技术对所得序列进行分离，采用软件QuantityOne对12个样品的DGGE图谱进行分析。结果共得至1]ll条不同位置的条带，各个月份的条带数目相似，其中9条条带作为共有条带在全年均有分布，占总条带数的81．82％。表明栉孔扇贝消化盲囊群落结构组成相对稳定。选取其中9条荧光强度较高的条带进行测序，所测序列与NCBI数据库中相应16SrDNA序列的最大相似性在97‰99％之间，分属于变形茵门、放

7、线菌门、厚壁菌门(Firmicutes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)。其中，B．变形菌亚门占所测序列的11．1l％，6．变形菌亚门占22．22％，厚壁菌门占22．22％，蓝细菌门占11．11％，放线菌门占33．33％。4)平板培养方法从健康扇贝消化盲囊中分离到28株菌，经16S鉴定主要分属于弧菌属(Vibrio)，23株；Tenacibaculum属，3株；Colwellia属，1株；Ruegeria属，l株。选择其中分属不同属的3株菌(E8：啪砌，E14：Ruegeria，E19：Tenaci

8、baculum)进行感染实验，每只注射1．7×106个细菌，以注射无菌生理盐水组做对照。分别在感染后的第ld，3d，5d，7d，9d取样，测定血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(—U@)和超氧化物歧化酶(SOD)活力，并记录死亡情况。结果发现，注射菌E8(Hbrio)的扇贝10天后的平均死亡率达到了26．25％，显著高于对照(5％)，注射E14菌株扇贝死亡率则稍低于对照，注射E19菌株，扇贝死亡率稍高于对照。