表达高致病性猪蓝耳病病毒（hun4株）gp5重组伪狂犬病毒的构建与鉴定

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1、摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PR_RS)也称猪蓝耳病，是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种严重的病毒性传染病，该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。自1987年首次发现以来，该病广泛流行于世界各主要养猪国家和地区，已成为威胁养猪业的主要疫病之一。2006年以来，由该病毒变异株引起的高致病性猪蓝耳病(Highlypathogenicp

2、orcinereproductiveandrespiratorysyndrome，HPPRRS)在我国广泛流行给养猪业带来了巨大的损失。包括灭活苗和弱毒苗在内的传统PRRS疫苗对HPPRRS只能起到部分保护作用，因此研制针对HPPRRS的高效的疫苗显得极为迫切。本实验室在研制HPPRRS常规疫苗的同时，也开展了利用基因工程技术构建表达HPPRRS病毒GP5的重组活载体疫苗，发挥此类疫苗多价并且可以作鉴别诊断的优点，探索基因工程疫苗作为HPPRRS常规疫苗的补充，为防治HPPRRS的生物制品提供更多的选择。GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白，也是PRRSV重要的中和抗原，

3、用含GP5基因的质粒DNA进行免疫，接种的猪产生了抗PRRSV的中和抗体，并可使接种猪在强毒攻击后得到有效保护。GP5基因在不同PRRSV毒株之间遗传变异较大。为了更清晰地了解PRRSV的遗传变异特征，本研究选取了PRRRSV的代表毒株和国内高致病性猪蓝耳病的代表株、及标准毒株HuN4株及其传代毒的GP5序列进行同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明：本文分析的我国分离株为北美洲型，且与2006年后我国分离的其它高致病性猪蓝耳病病毒GP5间存在较高的同源性，而与国内经典的流行毒株差异较大，且存在关键氨基酸的突变和一些规律性的点突变。本实验室已经构建的以伪狂犬病毒Bartha-

4、K61株为载体表达PRRSVCH—la株的GP5重组病毒，免疫猪后可以有效的抵抗PRRSVCH．1a株强毒的攻击。但由于HPPRRS病毒的GP5与PRRSVCH．1a株GP5氨基酸的同源性只有93％，影响了该重组病毒对HPPRRS的保护效果。因此，本研究通过构建表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒，为将来探讨其是否能够成为有效防制HPPRRS的疫苗奠定基础。本研究以经典的伪狂犬弱毒疫苗Bartha-K61株为载体，构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为选择标记的表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒。构建了含HPPRRS病毒GP5基因和EGFP

5、报告基因的PRV转移载体，经酶切、PCR鉴定后为阳性的质粒命名为pgG．HPGP5一EGFP。将该质粒纯化后，采用LipofectaminVM2000瞬时转染293T细胞，转染后48h后EGFP表达效率最高。利用磷酸钙转染方法将质粒DNA和PRVBartha-k61株的基因组共转染Vero细胞，转染后60""72h观察细胞病变，将带有绿色荧光病变的转染产物收获，从F2代开始采用蚀斑克隆的方法纯化重组病毒，经6轮蚀斑纯化，获得了稳定表达EGFP的重组病毒，我们将得到的重组病毒命名为rPRV-HPGP5。对第8代重组病毒进行PCR、Westernblot和IFA鉴定。PCR扩增

6、到了GP5基因并且重组病毒仍为gE缺失株，通过IFA和Westernblot鉴定证实HPPRRS病毒HuN4株GP5基因得到了有效表达。关键词：PRRSV，高致病性猪蓝耳病，GP5基因，重组病毒AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，amemberoftheArteriviridae，iswidespreadamongtheswinepopulation，causingreproductivefailureinSOWSandrespiratorydisordersinpigsofallage

7、s，andhasalleconomicimpactonthepigindustryworldwide．Anemergedhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(HPPRRSV)，occurredinthepigsinmainswineindustryprovincesofmainlandChinain2006，whichmadeabiglossintheraiseofpigs．Aswekoown，thevaccinesagains