vegf转染对骨髓间质干细胞及对粥样硬化动脉tfpi的影响

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1、中南大学博士学位论文中文摘要摘要研究背景动脉粥样硬化是一种全身动脉血管性疾病，临床上常表现为心肌梗死、脑卒中、主动脉瘤、主动脉夹层及下肢间歇性跛行等，有极高的致残率和致死率，是危害人类健康的主要疾病。但是，动脉粥样硬化的病因尚未完全确定，治疗效果还不满意，因此探讨动脉粥样硬化的发生机制和寻找有效的治疗方法具有十分重要的意义。血管内皮生长因子ⅣEGF)具有多种生物学活性，如促进血管内皮细胞增殖和血管新生、促进多种血管活性物质合成、促进血管舒张、抑制血栓形成、抑制血管平滑肌细胞增殖等，其中促进血管内皮细胞增殖作用具有高度特异性。在动脉粥样硬化中，一方面VljGF具有刺

2、激一氧化氮和前列环素2产生，增强内皮完整性，抑制血管平滑肌细胞增殖，增加内皮抗血栓等血管保护作用；另一方面ⅦGF可能加速动脉粥样硬化斑块进程，加重血管损害。所以，进一步了解VEGF生物学作用的确切机制在防治粥样硬化方面具有重要意义。在动脉粥样硬化中血栓形成是重要危害因素，血管内血栓形成导致器官组织坏死，是导致我国居民死亡的首要原因之一。组织因子途径抑制物(TFPI)是体内极为重要的天然抗凝物质，内皮是其合成、储存和降解的场所。文献表明：急性心肌梗塞患者血浆中研PI的浓度明显升高，缺血性心脏病、血脂异常、糖尿病等患者血浆中TFPI的浓度也有明显升高，在病情好转过程中

3、，邛PI进行性下降。研究发现溶栓失败患者TFPI表达下降，考虑溶栓失败与TFPI的降低有关，犬血栓模型实验证实联合应用ⅡPI与tPA后，溶栓疗效明显提高。另有动物实验表明：在血管壁进行TFPI基因转移可防止局部血栓形成。文献显示：动脉粥样硬化病变中Ⅶ(陋与TFPI呈同相改变，且密切相关，但其相互作用机制并不清楚。本实验设想通过调节ⅦGF基因观察盯PI的变化，进一步探讨二者的关系，寻找同相调节二者的方法，达到既稳定血管内皮又抑制血栓形成的作用，以达到更有效治疗动脉粥样硬化目的。骨髓间质干细胞是一种具有高度增殖和分化能力的成体干细胞。近年来发现骨髓间质干细胞在特定的条

4、件下还可以向血管内皮细胞分化。骨髓间质干细胞不仅具有干细胞的共性，而且具有来源丰富、无免疫排斥、无年龄限制、无伦理学争议，能够转染和长期表达外源中南大学博士学位论文中文摘要性基因。本实验选择骨髓间质干细胞为工程细胞。砌町A干扰是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白质水平及功能，它能快速而准确敲除特定基因。许多研究在动物疾病模型或培养细胞中，利用该项技术阻断相关基因的表达。本研究通过转染ⅥjGF和沉默ⅦGF观察TFPI变化，初步了解二者的相互关系，探索以骨髓间质干细胞为工具的基因治疗，寻找新的有效的动脉粥样硬化治疗方法。一、载体的构建

5、目的构建pcDNA3．1(．)ⅦGF真核表达载体；构建针对ⅦGF的发卡样siRNA真核表达载体pU．Ⅵ3GF．siRN虬为进一步研究其对动脉粥样硬化的作用奠定基础。方法应用DNA重组方法，将编码ⅦGFcDNA定向克隆于真核表达载体pcDNA3．1(-)中，构建pcDNA3．1(一)ⅦGF真核表达质粒，通过酶切及测序鉴定；合成一对互补并编码相应短发夹状ⅦGF．siIⅢA的寡核苷酸链，将其插入到pSiIencc—12．1一U6neo载体中，经测序鉴定所构建的重组载体是否正确。结果酶切结果与相应的载体和基因相同，对pcDNA3．1(．)ⅦGF进行测序，结果表明ⅦGF已正

6、确克隆到pcDNA3．1(．)质粒；测序示pU-VE(m．si对蛆序列正确。结论pcDNA3．1(-)Ⅵ；GF、pU．ⅥjGF．siIⅢA真核表达载体构建成功。目的二、VEGF对人骨髓间质干细胞TFPI的影响建立骨髓间质干细胞分离、培养的方法，观察其生物学特性，对lI中南大学博士学位论文中文摘要分离、培养的骨髓间质干细胞进行鉴定；观察真核表达载体pcDNA3．1(．)ⅦGF、pU．vEGF—siRNA转染骨髓间质干细胞后ⅦGF、1FPImRNA表达的变化及vEGF、TFPI蛋白质水平的变化。方法1．抽取幼儿骨髓，Percoll溶液密度梯度离心法分离后，将细胞重悬在

7、人的骨髓间质干细胞培养基中培养，检测其生物学特性及多向分化潜能。2．脂质体介导pcDNA3．1(．)Ⅵ!GF质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞，荧光显微镜观察转染效果，lmPCR方法检测转染后骨髓间质干细胞ⅦGF、Ⅱ甲IIn】妣～表达水平，免疫印迹法半定量检测转染后骨髓间质干细胞ⅦGF、TFPI蛋白质水平，M丌怯检测转染后骨髓间质干细胞培养上清液ⅦGF的生物学活性；3．脂质体介导pU-v】iGF—siRNA质粒转染体外培养的骨髓间质干细胞，荧光显微镜观察转染效果，RT-PCI坊法检测转染后骨髓间质干细胞vEGF、ⅡPImRNA表达水平，免疫印迹法半定量检测转染后骨髓

8、间质干细胞