海产品中异尖科线虫生物学检测技术的研究

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1、＼,＼吣、(㈣'t8删30㈣059海产品中异尖科线虫生物学检测技术的研究学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：j萄军夺；参濒／∥躬搬r／，J，，独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得!逵!垫逡查基丝盏噩挂剔重盟笪：奎拦亘窒≥或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论

2、文作者签名：许，他签字日期：2口卢年j。月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：许灿导师签字：签字日期：l

3、o／o年箩月巧日‘右荔参签字日期：Wco年卜月>坫海产品中异尖科线虫生物学检测技术的研究摘要蛔目异尖科线虫(anisakidlarvae)，是一类广泛分布于海洋动物的寄生虫，人类异尖线虫病是因为食入了含活异尖科第三期幼虫的海鱼和鱿鱼而引起。我国出入境部门相继报道进口鱼类查出该幼虫，并将异尖线虫列为国家禁止入境的二类动物寄生虫。近些年随着生鲜海产品消费量的增多，我国人民感染异尖线虫病的可能性不断加大，海产品中异尖线虫的潜在危害应引起足够的重视。目前，对于异尖科线虫的检测，主要是水产品加工企业采用灯检方式对海产

4、品中的寄生虫进行在线筛选检测，但更为准确、实用的检测方法则较为缺乏。本论文主要从海产品中异尖线虫的酶消化检测，间接竞争酶联免疫检测，直接竞争酶联免疫检测等方面进行研究，并将建立起来的生物学方法与灯检法进行了比较和验证试验，主要实验结果如下：1．酶消化检测研究中，确定了酶水解鱼肉的最佳条件为：初始pH值为1．1，温度为37℃，酶活力为8U／mL左右；消化后所得的虫体采用多重PCR方法替代传统的形态学观察进行种属鉴定，从而初步建立了基于酶水解一多重PCR的异尖线虫的酶消化检测体系。实际样本检测表明，该技术可以较

5、为准确、快速地用于海产鱼类中简单异尖线虫0nisakissimplex)和伪地新线虫(Pseudoterranovadecipiens)的确证性检测。2．以纯化的鼠多克隆抗体为检测材料，初步建立起海产鱼类中异尖科线虫的间接竞争酶联免疫(Ci-ELISA)检测方法，该方法检测简单异尖线虫检测限为46．9ng／mL，线性范围为60～600ng／mL；检测伪地新线虫检测限为78．7ng／mL，线性范围为100一--1500ng／mL。孔间变异系数为6．2％'--'9．1％，板间变异系数为7．7％'---21．0％

6、。以鳕鱼和鲽鱼作为加标样品，在0．5条／1009～2条／1009的加标范围内，该方法检测简单异尖线虫和伪地新线虫回收率约为65．2％"--99％，相对标准偏差低于15％。3．以纯化的兔多克隆抗体为材料，采用过碘酸钠氧化法制备酶标记简单异尖线虫兔多克隆抗体，并且建立起海产品中异尖科线虫的直接竞争酶联免疫(Dc．ELISA)检测方法，该方法检测简单异尖线虫检测限为53．Ong／mL，检测伪地新线虫检测限为60．Ong／mL，线性范围为100"-'-'5000ng／mL。孔间变异系数为1．0％'---14．2％，

7、板间变异系数为9．6％～19．8％。以蓝点马鲛、鲽鱼和鱿鱼作为加标样品，采用BSA稀释法有效克服了基质效应的干扰，在2条／1009--一10条／1009的加标范围内，该方法检测简单异尖线虫和伪地新线虫回收率约为77．8％～107．0％，相对标准偏差低于20％。该方法可以在100min内对海产品中异尖科线虫的特异性筛选检测。4．分别采用直接竞争ELISA和酶消化方法检测经灯检过的南鳕样本，结果表明，经灯检呈阳性的所有样本采用两种生物学方法检测均呈现阳性。10份灯检呈阴性的样本采用直接竞争ELISA方法检测结果

8、均为阴性，而另外20份灯检呈阴性的样本采用酶消化法检测结果有2份样本检出简单异尖线虫，其余均未检出。5．综合各种研究结果，分析各种检测方法的特点和适用范围，归纳总结出了海产品中异尖科线虫检测建议性流程。即先将大量的原料采用灯检法进行初步筛选和挑虫，然后再进行免疫学方法的筛选和酶消化法的确证性检测流程。关键词：异尖科线虫；酶消化；ELISA；海产品；检测DeveIopmentofbi0IogicaImethodsf