微生物法不对称还原β羰基苯丙酸乙酯制备(s)()β羟基苯丙酸乙酯的研究

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1、浙江工业大学学位论文原创性声明11111111Illl111111111IIl、1776650本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者签名：淹、盹专日期：彤年y月叫日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机

2、构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在——年解密后适用本授权书。2、不保密彭(请在以上相应方框内打“、／’，)作者签名：阻毗．，磊导师签名：日期：动年y月叫日日期：≯Itl年厂月咖浙江工业大学药学院2010年硕士毕业论文微生物法不对称还原p一羰基苯丙酸乙酯制备(s)．(．)．p一羟基苯丙酸乙酯的研究摘要本文对微生物法不对称还原p．羰基苯丙酸乙酯制备(S)．(．)．p．羟基苯丙酸乙酯的反应进行

3、了研究。通过对实验室保藏菌种进行筛选，获得一株对底物还原能力较强的菌株SaccharomycescerevisiaeB5，并对还原条件进行优化，确定了反应的最优条件为：采用初始pH为8．0的液体发酵培养基培养的SaccharomycescerevisiaeB5经过50℃预热处理30min后用于生物转化，转化条件为pH7．0，温度30℃，转化时间24h，底物浓度为3．63mmol／L，菌体用量为86g／L(干重／反应体积)，以10％葡萄糖为辅助底物。在最佳转化条件下反应转化率及(S)．(．)．p．羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可分别达到98．4％和100％ee。将得

4、NN(s)．(一)．p．羟基苯丙酸乙酯粗品用溶剂萃取和柱色谱相结合的方法进行分离纯化。转化液经离心弃去微生物细胞后用正己烷萃取上清液，萃取液经蒸馏除去正己烷后，获得的样品用硅胶柱进行层析分离。硅胶柱层析的最佳沈脱条件为：洗脱液石油醚与乙酸乙酯的体积比为7：l，洗脱液流速为1．5ml／min，上样量为4．8mg／ml硅胶，径高比为1：12。获得的(S)一(-)一p一羟基苯丙酸乙酯的纯度为98．2％，对映体过剩值为97．5％。通过对还原反应过程中细胞内NADP和NADPH的浓度进行测定，确定参与不对称还原的辅酶为NADPH。通过测定反应过程中底物和产浙江工业大学药

5、学院2010年硕士毕业论文物浓度的实验数据对动力学方程进行拟合，得到动力学参数为：Vm=5．OxlO—mol·t"l'h一，岛=1．5×10击mol·L-1．h-1，岛=3．OxlO—mol·L-1．h-1。动力学模型为：，，一5．OxlOq·g·CNADPH1，=--————————-—-———--—-——————--——————---—--———-——=—————————————-—--——-—————--——-—-——．——一1．5×10一·CNADPH+1．5×10．6x3．0xl0七+q·CNADPH动力学模型能较好地拟合实验数据。在膜反应器中对微生

6、物还原制备(S)．(．)．p一羟基苯丙酸乙酯的连续反应进行了研究，考察了操作条件对反应器生产能力及底物转化率的影响，并建立了连续反应过程的动力学模型。确定了合适的超滤膜截留分子量为30KDa，在O．1MPa的压力下进行连续反应，生物量为86g／L，膜通量为20ml／min，所能达到的最大生产能力为O．136h-1。底物处理量为l8．29mmol时连续反应7d产物的产率为3．68mm01．L-1．d-1。150ml生物量为86g／L菌液一次性转化18．29mmol底物的转化率为零。可见，连续反应的转化率远远高于分批反应的结果。连续反应可以解除高底物浓度对反应过程

7、的抑制。对连续反应过程建立的动力学模型能较好地拟合实验数据，得到的动力学参数为：％=3．OxlO。tool·L"1．h～，‰口t--3．5xlO～mol·L"l-h～，幻=3．1x10～mol·L一，岛=5．Oxl04m01．I，～。关键词：不对称还原，SaccharomycescerevisiaeB5，p．羰基苯丙酸乙酯，(S)．(一)．p一羟基苯丙酸乙酯IISTUDYOFASYM瓜征!TIUCREDUCTIONOF3-OXO-·3--PHENYLPROPIONICACIDETHYLESTERUSINGSACCHAROMYCESCEREVISIAEB5ABS

8、TRACTThecarbonylasy