一种新的短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化与酶学性质的研究

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1、短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究摘要本研究从皮革厂、畜肉市场和屠宰场等处采样，分离得到49株具有明胶水解活性的微生物。菌株C01．C的培养液能在48h内对犊牛皮有明显消化作用，菌株C01．J则能完全消化。经形态学观察、生理生化培养和16SrDNA序列分析，鉴定菌株C01．C为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescen)，菌株Col-J为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。以ⅡI型酸性胶原蛋白为底物，菌株C01．C和菌株C01．J的胶原蛋白酶活性分别为21．19U／mL和35．97U／mL。菌株C01．J培养

2、液的活性凝胶电泳实验表明，该菌至少产生了3种具有胶原蛋白酶活性的同工酶。以短小芽孢杆菌C01．J为材料，进行胶原蛋白酶的分离纯化。发酵液离心去菌体，上清分别采用30％饱和度和75％饱和度的硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解后，透析脱盐、浓缩。将样品过SephadexG．100分子筛层析柱，收集活性峰S1。然后用过SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱，收集活性峰Q3。SDS．PAGE检测表明，得到的电泳纯胶原蛋白酶，分子量约为58．64kD。结果表明，本实验对胶原蛋白酶的纯化倍数为31．53，回收率为7．00％。对纯化后的胶原蛋白酶进行酶

3、学性质研究，结果表明：该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为7．5。具有较强的耐热性，经30℃巧5℃处理5min后仍能相对稳定，可保持在最高酶活的60％以上。经pH6．pH8．5的缓冲液处理30min后相对稳定，能保持在最高酶活的60％以上。离子影响实验表明，50mmol／L的Li+、l(+、Zn2+、M孑+、ca2+和8a2+对胶原蛋白酶具有一定的激活作用，而50mmol／L的Na+、Mn2+、Fe3+和Pb2+，以及0．Olmmol／L的EDTA、EGTA和巯基乙醇则能抑制胶原蛋白酶的酶活。其中，Ca2+对酶的激活作用最强，相对酶

4、活达到127％；而EGTA对酶的抑制作用最为强烈，相对酶活仅为10．1％。底物特异性实验表明，该酶对III型酸性胶原蛋白具有较高的专一性。在pH7．5，45"C条件下，该胶原蛋白酶对酸性可溶胶原蛋白III的米氏常数Km为0．79mg／mL，最大反应速度％脚为0．1295mg／(min·mE)。与已有报道的胶原蛋白酶性质比较表明，从短小芽孢杆菌C01．J分离纯化的该酶是一种新的胶原蛋白酶。关键词：短小芽孢杆菌；胶原蛋白酶；分离纯化：性质PurificationandCharacterizationofaCollagenasefromBacil

5、luspumilusAbstractForty—ninemicrobeswithcollagenaseactivitywereisolatedfromtannery,poultryandabattoirsamplesinthestudy．Thesupernatantoftwostrains，namedCol-CandCol-J，coulddigestthecalfskinobviouslyandcompletely．Basedonthepolyphasicstudies，includingtheirphenotypic，physio—bio

6、chemicalcharacteristics，16SrDNAphylogeneticanalysis，Col—CandCol·JwereidentifiedasSerratiamarcescenandBacilluspumilus，respectively．CollagenasefromthesupematantofBacilluspumilusCol-Jwaspurified．AmmoniumsulfateWasaddedto30％saturationandthen75％insupernatant．AndtheprecipitateWa

7、scollectedbycentrifugation，thenthepelletWasdissolvedandthefractionwasdialyzed．ThematerialWaSthenappliedtogelfiltrationchromatographyonaSephadexG-100column,FractionshowingcollagenaseactivitywerecellectedthenWaSputonaion-exchangechromatographyonSepharoseFastFlowafterbeingcon

8、centrated．KeeptheactivefractionQ3．SDS-PAGEshowedthatthemolecularmassoftheelectrophoresisp