不同浓度fk506对雪旺细胞影响的实验的研究

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1、不同浓度FK506对雪旺细胞影响的实验研究硕士生姓名：蒋华军指导教师：曲巍教授指导小组：张卫国教授专业名称：外科学摘要随着组织工程技术的发展，周围神经缺损的修复可望使用体外构建的人工神经修复解决。人工神经是以具有良好的生物相容性的可降解高分子聚合物为载体与有活性的种子细胞结合而成的复合体。雪旺细胞(SchwannCell)最重要的种子细胞，这种细胞可以合成和分泌细胞外基质成分并和其他分子一起构成基板，形成有髓神经纤维的髓鞘和无髓神经纤维的内膜，而且雪旺细胞还分泌多种神经营养因子包括NGF(神经生长因子)等，对神经损伤后的轴突再生和功能恢复起着不可替代的作用。如果有雪旺细胞提供营养支持神

2、经再生距离将增加，而无细胞的神经移植再生距离则较短。FK506是继环孢素A之后发现的一种新的强效免疫抑制剂，其免疫抑制作用大约是环孢素A(CsA)的1O倍。近年来一系列研究表明，FK506除较强免疫抑制作用外，更有促神经生长作用，其受体蛋白．FKBP(FKS06BindingPro．tein)在神经系统内的含量极其丰富，大约是免疫系统中的lO～50倍。如果FK506在人工神经中稳定而持久的释放，将对作为种子细胞的雪旺细胞起到保护作用。目的：1．采用新生SD大鼠的雪旺细胞作为周围神经组织工程的种子细胞，在体外分离培养，探索体外培养及增殖雪旺细胞的有效方法。2．选取生长状况和纯度较好的第二

3、代细胞，研究不同浓度的FK506对体外培养雪旺细胞增殖及分泌功能的影响。探讨FK506在组织工程化人工神经中应用的可能性。方法：I．取3～5天SD大鼠的双侧的坐骨、臂丛神经，剪碎至1mm3大小的组织块，双酶消化法进行分离培养，低浓度胰酶快速消化传代进～步纯化雪旺细胞，用光镜进行形态学观察、S．100蛋白进行鉴定。2．将纯化的雪旺细胞分四组，一组设为对照，另三组分别加含终浓度为106mol／L、10-7mol／L、l0-smol／LFK506的DMEM培养液培养。原代细胞计数，观察雪旺细胞增殖情况：传代细胞MTT法检测不同时间点的OD值并绘制生长曲线，用ELISA法检测FK506促雪旺细

4、胞分泌神经生长因子(NGF)的含量。动态观察不同浓度FK506作用下雪旺细胞生长、活性及分泌功能状态。结果：1．通过上述方法分离培养获得了增殖迅速的原代雪旺细胞，经S．100蛋白鉴定为雪旺细胞，经传代进一步纯化后各组雪旺细胞纯度均可以提高到90％以上。2．各组传代雪旺细胞培养3～5天后，细胞增殖明显。第1～3天，FK506组雪旺细胞的细胞活性与对照组相比，并无显著性差异。3天以后，FK506组的雪旺细胞生长明显优于空白对照组，差异有统计学意义(P<0．05)。3．ELISA法检测结果显示FK506可明显促进雪旺细胞分泌NGF，而且随着时间的延长而逐渐增高，第4～8天时分泌量维持较高的水

5、平，其中第6天时分泌量最高。而10-gmol／L组最为理想。结论：1．采用出生3～5d的幼年鼠，坐骨神经及臂丛神经切取相对容易，纤维结缔组织成分较少，培养获得雪旺细胞贴壁良好，增殖速度快，易于培养观察，可以满足神经组织工程研究的需要。2．FK506可以促进雪旺细胞增殖和NGF分泌的作用，FK506作用表现为对雪旺细胞明显的保护作用，这种作用在较低浓度(10-smol／L)时效果更明显。3．体外培养雪旺细胞，FK506对雪旺细胞数量、活性及分泌功能有促进作用，这种作用可能是促进损伤神经再生加快神经生长速度的关键。关键词：雪旺细胞神经生长因子细胞培养FK5062Andose·depende

6、ncestudyofFK506onSchwanncellsMasterdegreecandidate：Hua-junJiangSupervisor：ProfessorProWeiQuVice·-supervisor：ProWei·—guoZhangMajor：Surgery，OrthopaedicsAbstractWiththedevelopmentoftissueengineeringofperipheralnervoussystem，thelackofautologousnervepossiblycouldbesolvedbyartificialnerve．Artificialne

7、rveiscomposedofseedcellandbiomaterialswhichcanbedegrade．Schwanncellsarethemostimportantseedcellswhichcansynthesizeandsecreteextracellularmatrixandotherelementsconstitutethesubstrate，andenvelopingtheaxonstoformmyelinatednerve